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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-opus-44794

Untersuchungen zum Einfluss von Bosentan und CA-074 Me auf Proliferation und Migration von Glioblastomzellen

  • Das Glioblastoma multiforme zählt bis heute trotz multimodaler Therapieansätze zu den prognostisch ungünstigsten malignen Neoplasien des Menschen. Ein mittleres Überleben von etwa 15 Monaten unter der derzeitigen Standardtherapie konnte trotz intensiver Forschung bislang nicht wesentlich gesteigert werden. Die hohe Proliferationsrate und das ausgeprägte infiltrative Wachstum sowie die fehlende Radio- und Chemosensitivität dieser Tumorentität limitieren bis dato die therapeutischen Optionen. Vor diesem Hintergrund ist die Etablierung alternativer Therapieansätze eine vordringliche Forschungsaufgabe. In Glioblastomen konnte eine erhöhte Expression von Komponenten der Endothelin-Achse sowie der Cystein-Protease Cathepsin B nachgewiesen werden. In anderen malignen Neoplasien wie dem Kolon-, Mamma- oder Prostatakarzinom vermochte die Hemmung dieser Hormone/Enzyme die proliferative und migratorische Aktivität der Tumorzellen zu vermindern, wobei gewebespezifische Differenzen sowie Ambivalenzen der Inhibitionsresultate zu beobachten waren. In dieser Dissertation sollte unter in vitro-Bedingungen das Expressionsverhalten der Glioblastomzelllinien LN 18 und U 87 MG hinsichtlich obig genannter Systeme sowie der Einfluss einer dualen Blockade der Endothelin-Rezeptoren A und B durch Bosentan bzw. der selektiven Inhibition von Cathepsin B durch CA-074 Me auf die zelluläre Proliferation und Migration untersucht werden. Mittels quantitativer RT-PCR konnte in beiden Zelllinien – verglichen mit gesundem Hirngewebe – eine erhöhte mRNA-Expression sowohl der Endothelin-Achse als auch von Cathepsin B nachgewiesen werden. Die Western-Blot- und ELISA-Untersuchungen bestätigten eine erhöhte Expression von Endothelin-1, dem ETAR und dem ETBR sowie von Cathepsin B in beiden Zelltypen. Im Weiteren wurde der Einfluss der Inhibitoren Bosentan und CA-074 Me auf die Proliferation der beiden Zelllinien im Resazurin- und Kristallviolett-Assay sowie auf die Migration im xCelligenceTM-System und im Wundheilungs-Assay untersucht. Ein signifikanter Einfluss von Bosentan konnte in den durchgeführten Experimenten in beiden Zelllinien weder für die Proliferation noch die Migration nachgewiesen werden. Für CA-074 Me zeigte sich jedoch in einer Konzentration von 10 µM ein hemmender Einfluss auf die Zellviabilität sowie die Migration der Zelllinien LN 18 und U 87 MG. Längere Inkubationszeiten und höhere Konzentrationen der verwendeten Inhibitoren, wie in der Fachliteratur beschrieben, sollten in weiterführenden Analysen in die Experimente eingeschlossen werden. Die ebenfalls in die Untersuchungen eingeschlossenen Zytostatika Doxorubicin, Teniposid und Vincristin bewirkten eine signifikante Reduktion der Zellviabilität beider Glioblastomzelllinien, während Carmustin, Lomustin und Temozolomid kaum Einfluss auf diese Zellen nahmen. Weder Bosentan noch CA 074 Me führten dabei zu einer signifikanten Modulation der Zytostatika-Wirkungen. Alle untersuchten Zytostatika verursachten zudem eine verminderte Migration der Glioblastomzellen in vitro, jedoch war das Ausmaß dieser Migrationshemmung sehr unterschiedlich. Auch hier konnte kein Einfluss von Bosentan oder CA 074 Me auf die durch die Zytostatika verursachte Hemmung der Zellmigration beobachtet werden. Die Komplexität und Multifunktionalität beider Hormon-/Enzymsysteme innerhalb verschiedener Zellkompartimente und Gewebetypen machen weitere Untersuchungen in vitro und in vivo notwendig, um das Potenzial beider Systeme für einen gezielten Einsatz in der Tumortherapie bzw. der Behandlung des Glioblastoms vollends zu klären. Zudem muss berücksichtigt werden, dass bei Verwendung pharmakologischer Hemmstoffe unspezifische bzw. pleiotrope Effekte nicht gänzlich ausgeschlossen werden können, weshalb weiterführende Analysen mit gezielter, genetischer Ausschaltung der Zielgene, beispielsweise mittels siRNA oder CRISPR/Cas9-Technologie, sinnvoll erscheinen.
  • Glioblastoma multiforme remains one of the most prognostically unfavorable human malignant neoplasms. A median survival of 15 months for patients suffering from glioblastoma multiforme following standard of care has not been substantially prolonged, despite considerable scientific effort being invested in multimodal therapeutic approaches. The high proliferation rate and the pronounced infiltrative growth as well as the lack of radio- and chemosensitivity of this tumor entity limit the therapeutic options to date. Against this background, the establishment of alternative therapeutic approaches is an urgent research task. In glioblastoma multiforme tissue, increased expression of components of the endothelin axis as well as the cysteine protease cathepsin B could be detected. In other malignant neoplasms such as colon, breast or prostate cancer, inhibition of these hormones/enzymes decreased proliferative and migratory activity of tumor cells with tissue-specific differences as well as ambivalences of inhibition results. In this dissertation, the expression behavior of the glioblastoma cell lines LN-18 and U 87 MG with regard to the above mentioned systems and the influence of dual blockade of endothelin receptors A and B by bosentan or selective inhibition of cathepsin B by CA-074 Me on cellular proliferation and migration were investigated under in vitro conditions. By quantitative RT-PCR, increased mRNA expression of both the endothelin axis and cathepsin B was detected in both cell lines compared with healthy brain tissue. Western blot and ELISA studies confirmed increased expression of endothelin-1, the ETAR, and the ETBR as well as cathepsin B in both cell types. The influence of the inhibitors bosentan and CA-074 Me on the proliferation of the two cell lines was investigated utilizing resazurin and crystal violet assays, the influence of the inhibitors on cellular migration was analyzed using the xCelligenceTM system and the wound healing assay. A significant effect of bosentan could not be detected for either proliferation or migration in the experiments performed in both cell lines. However, for CA-074 Me, an inhibitory effect on cell viability as well as migration of cell lines LN 18 and U 87 MG was shown at a concentration of 10 µM. Longer incubation times and higher concentrations of the inhibitors used, as described in the literature, should be included in the experiments in further analyses. The cytostatic drugs doxorubicin, teniposide and vincristine, which were also included in the studies, caused a significant reduction in cell viability of both glioblastoma cell lines, whereas carmustine, lomustine and temozolomide had little effect on these cells. Application of neither bosentan nor CA-074 Me resulted in a significant modulation of the cytostatic effects. All cytostatic agents studied also caused decreased migration of glioblastoma cells in vitro, but the extent of this migration inhibition varied widely. Again, no effect of bosentan or CA 074 Me on the inhibition of cell migration caused by the cytostatic drugs was observed. The complexity and multifunctionality of both hormone/enzyme systems within different cell compartments and tissue types necessitate further studies in vitro and in vivo to fully clarify the potential of both systems for targeted use in tumor therapy or treatment of glioblastoma multiforme. In addition, it must be taken into account that non-specific or pleiotropic effects cannot be completely excluded when pharmacological inhibitors are used, which is why further analyses with genetic silencing of the target genes, for example using siRNA or CRISPR/Cas9 technology, appear to be useful.

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Metadaten
Author: Hendrik Strothmann
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-44794
Title Additional (German):Studies on the influence of Bosentan and CA-074 Me on proliferation and migration of glioblastoma cells
Referee:Prof. Dr. med. Bernhard H. Rauch, Prof. Dr. med. Timo Kirschstein
Advisor:Prof. Dr. med. Bernhard H. Rauch, Dr. rer. nat. Sandra Bien-Möller
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2021
Date of first Publication:2021/04/20
Granting Institution:Universität Greifswald, Universitätsmedizin
Date of final exam:2021/03/18
Release Date:2021/04/20
GND Keyword:Glioblastoma multiforme, Bosentan, Pharmakologischer Antagonist
Page Number:144
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Pharmakologie
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit