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Daniel Schultz

• Bioactive lipids or lipid mediators influence numerous processes like the reproduction, the bone turnover, the pain perception, the cardiovascular function and the immune system. Eicosanoids and oxylipins are parts of the immunomodulatory lipid mediators, which can be synthesized from polyunsaturated fatty acids (PUFAs) by enzymatic and non-enzymatic reactions. Typical members of eicosanoids are prostaglandins and leukotrienes. The properties of bioactive lipids include the activation of inflammatory reactions as well as the support of resolution. Like hormones, they act locally restricted and in low concentrations. Further bioactive lipids exist i.e. intermediates of the sphingolipid class. The biosynthesis of some of these compounds like the prostaglandins can be influenced by different drugs whereas for other groups of lipid selective inhibitors are still missing. Their impact on inflammatory processes and against chronic diseases has already been analyzed, while studies in context with infection are largely limited. Infection of the upper respiratory tract caused by viral and bacterial pathogens constitute a huge burden for the human healthcare. The main pathogens are the Influenza A virus (IAV), Staphylococcus aureus (S. aureus), Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) and Streptococcus pyogenes (S. pyogenes). Besides mono-infection with one of these pathogens, frequently occurring bacto-viral co-infections exist, which negatively influence the etiopathology. The main task of the immune system is the detection and the elimination of pathogens, which can essentially be affected by lipid mediators. Their instability due to oxidizability, the existence of regioisomers and the low abundance of eicosanoids and other oxylipins are the main problems for their analytical measurement. The mayor objective of this dissertation was the establishment of a suitable analytical method for selected lipid mediators and the detection of infection-related changes. The separation and detection was performed by using high-performance liquid chromatography (HPLC) coupled with triple quad mass spectrometry. This combination is called tandem mass spectrometry (MS/MS). The MS parameters were optimized for approximately 30 lipid mediators by use of chemical standards and the detection was achieved by dynamic multiple reaction monitoring (MRM). Furthermore, the spatial resolution of selected sphingolipids was analyzed in tissue samples using matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging (MALDI-MS-Imaging). Concerning the HPLC-MS/MS detection, an MS method was established and optimized with standard compounds. Another crucial part of the establishment was the extraction of bioactive lipids from the different sampling materials. Whereas well tested protocols exist for the extraction and detection of lipid mediators, such protocols for MALDI-MS-Imaging are still limited due to the novelty of this measurement. Ultimately, robust and reproducible protocols for both techniques that were used for the analysis of a broad array of samples from infection experiments were established for both techniques. The analyses of infected cell culture, mice and pigs revealed infection-related perturbations of host lipid mediator levels. Depending on the scientific issue, the sample types cell pellets, lungs, spleens, livers, blood plasmas, pawns including bones or bronchoalveolar lavages were analyzed. For MALDI-MS-Imaging, the spatial distribution of sphingolipids in lung and spleen was detected. The present dissertation includes four coherent research scopes, in which the pathogen impact on host-derived lipid mediators was detected with the above mentioned analytical methods. The infection models epithelial cells (article II), mouse (article III and IV) and pig (article I) – the latter as the most human like model - showed different aspects of the host-pathogen interaction. The analysis of samples from IAV infection for all three hosts revealed a couple of similarities for some oxylipins that were also described in human infections. Additionally, cell culture and mouse samples from mono-infections as well as co-infections with the pathogens S. aureus and S. pneumoniae were measured. In particular for the bacterial mono- and co-infections, these are the first published results with aspects of infection related changes of lipid mediators. The additional spatial resolution of the sphingolipid intermediates sphingosine 1-phosphate and ceramide 1-phosphate revealed important new insights into their tissue distribution and changes during co-infection. Article I describes the IAV-specific oxylipin changes in the pig (german landrace) as infection model. Therefore, the sample types lung, spleen, blood plasma, and bronchoalveolar lavage from infected animals at different time points after infection were analyzed and compared with samples from uninfected pigs. Mainly in the lung and the spleen, increased amounts of certain lipid mediators were observed. These changes coincide well with already described alterations in humans and mice. Furthermore, the analysis of different sample material provided an overview about appropriate sample types. Surprisingly, many perturbations were detected in the spleen, which itself was uninfected. Based on the local reaction of lipid mediators, most studies concentrate on sample material with close contact to side of infection. Therefore, this dissertation reveals new insights into a form of systemic immune response. Besides the use of animals with a complex immune system for infection experiments, human bronchial epithelial cells (16HBE) were mono- and co-infected with the pathogens S. aureus, S. pneumoniae and IAV as described in article II. Such cells are the initial barrier for and first contact site with pathogens and thus the comprehension of this host-pathogen interaction is of essential importance. Most changes were detected during pneumococcal infection. Furthermore, the analyzed infections with bacterial pathogens differed from IAV infection by an increased synthesis of 5-hydroxyeicosatetraenoic acid (HETE). For further infections with the above mentioned pathogens, the mouse was used as an infection model. Besides infections affecting the respiratory tract, also the impact of an S. pyogenes infection in different mice strains was analyzed and described in article III. Infection-related changes in prostaglandins, which are involved in bone turnover in swollen pawns as well as enhanced amounts of sepsis- and arthritis-associated lipid mediators were detected, in case arthritis had been induced prior to infection. Furthermore, increased amounts of 20-HETE could be observed for such severe infections. An enhanced biosynthesis of 20-HETE was further confirmed in a high-pathogenic S. aureus LUG2012 infection in article IV for all examined sample types. In this last article of this dissertation, bacterial and viral infections in mice were analyzed similar to those described in article II. Mainly IAV-specific lipid mediator alterations were detected, which are in accordance with the findings of the infected pigs. The additional MALDI-MS-Imaging measurements revealed so far unknown accumulation of ceramide 1-phosphate in lung and spleen as well as enrichment in the red pulp of the spleen. In summary, this dissertation provides substantial lipid mediator profiles for infections in three different model systems with selected bacterial and viral pathogens. The obtained data constitute a suitable basis for continuative research projects, in which the influence of single bioactive lipids on the course of infection could be examined in more detail.
• Bioaktive Lipide beeinflussen zahlreiche Prozesse wie die Reproduktion, den Knochenumbau, die Schmerzwahrnehmung, das kardiovaskuläre System und das Immunsystem. Zu den immunmodulatorischen Lipidmediatoren gehören die Eicosanoide und Oxylipine, welche sowohl durch enzymatische als auch durch nicht enzymatische Oxidationen aus mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFAs) gebildet werden. Unter diesen Sammelbegriffen werden verschiedene Gruppen wie beispielsweise Prostaglandine oder Leukotriene zusammengefasst. Sie haben Eigenschaften, die sowohl die Aktivierung inflammatorischer Reaktionen als auch die Unterstützung der Auflösung von Entzündungen beinhalten. Sie wirken dabei ähnlich wie Hormone lokal begrenzt und in geringer Konzentration. Außerdem existieren noch weitere bioaktive Lipide wie Verbindungen aus der Klasse der Sphingolipide. Die Synthese einiger dieser Verbindungen wie die der Prostaglandine kann medikamentös beeinflusst werden, während andere Gruppen aktuell therapeutisch nicht gezielt inhibiert werden können. Ihr Einfluss während der Inflammationsprozesse und bei chronischen Entzündungen ist durch Studien belegt, aber Forschungsdaten im Zusammenhang mit Infektionen sind nur begrenzt vorhanden. Infektionen des oberen Respirationstraktes, verursacht durch virale und bakterielle Pathogene, stellen weltweit eine große Herausforderung für die menschliche Gesundheit dar. Wichtige Pathogene sind Influenza A Viren (IAV) sowie bakterielle Erreger wie Staphylococcus aureus (S. aureus), Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) und Streptococcus pyogenes (S. pyogenes). Neben Monoinfektionen mit einem der genannten Erreger kommt es häufig zu viralen-bakteriellen Ko-Infektionen, was den Krankheitsverlauf negativ beeinflussen kann. Die Erkennung der Pathogenen und deren Beseitigung ist die Hauptaufgabe des Immunsystems, welches wesentlich durch Lipidmediatoren beeinflusst wird. Die leichte Oxidierbarkeit, das Vorkommen von verschiedenen Regioisomeren und die geringe Abundanz der Eicosanoide und Oxylipine sind die Hauptgründe, weshalb ihre Analytik eine große Herausforderung darstellt. Eines der Hauptziele dieser Dissertation war die Etablierung geeigneter Messmethoden für ausgewählte Lipidmediatoren und deren Detektion in unterschiedlichen Probenmaterialien aus Infektionsversuchen. Die Trennung und Messung der bioaktiven Lipide erfolgte durch Hochleistungs-flüssigkeitschromatographie (HPLC) gekoppelt an ein Triple Quadrupol-Massenspektrometer, was als Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) bezeichnet wird. Für 30 Lipidmediatoren wurden die einzelnen MS-Parameter anhand von chemischen Standards optimiert und dann mit einer dynamic multiple reaction monitoring (MRM)-Methode gemessen. Außerdem konnte die räumliche Verteilung bestimmter Sphingolipide im Gewebe durch matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging (MALDI-MS-Imaging) analysiert werden. Neben den Messungen war die Probenaufarbeitung ein essentieller Bestandteil der Methodenetablierung. Während für die Analytik von Lipidmediatoren und deren Messung mittels HPLC-MS/MS gut erprobte Aufarbeitungsprotokolle existieren, standen solche für das neuartige MALDI-MS-Imaging nur begrenzt zur Verfügung. Schließlich konnten für beide Messmethoden robuste und reproduzierbare Protokolle erstellt und bei der Analyse zahlreicher Proben aus Infektionsexperimenten genutzt werden, in denen die wirtseigenen Lipidmediatorveränderungen von infizierten Zellkulturen, Mäusen und Schweinen untersucht wurden. Je nach Fragestellung wurden Zellpellets, Lungen, Milzen, Lebern, Blutplasma, Pfoten mit Knochen oder bronchoalveoläre Lavagen aufgearbeitet und die Proben analysiert. Durch das MALDI-MS-Imaging wurde die Verteilung ausgewählter Sphingolipide in Lunge und Milz der Mäuse detektiert. Die vorliegende Dissertation umfasst vier zusammenhängende Themenbereiche, in denen der Einfluss von Pathogenen auf wirtseigene Lipidmediatoren mit den oben genannten Methoden analysiert wurde. Die genutzten Infektionsmodelle Epithelzelllinie (Artikel II), Maus (Artikel III und IV) und Schwein (Artikel I), als humannahes Modell, zeigten unterschiedliche Aspekte der Wirts-Pathogen-Interaktion auf. Für alle drei Wirte konnten Proben aus einer IAV-Infektion analysiert werden, welche zahlreiche Gemeinsamkeiten für bestimmte Oxylipine zeigte, die in der Literatur auch für humanen Infektionen beschrieben sind. Zudem war es möglich, Proben aus Zellkultur- und Maus-Experimenten, welche mit den Pathogenen S. aureus, S. pneumoniae und IAV mono-infiziert und ko-infiziert wurden, zu untersuchen. Besonders bei den bakteriellen Infektionen und Ko-Infektionen handelt es sich um Erstbeschreibungen der Lipidmediatorveränderungen. Die zusätzliche räumliche Detektion der Sphingolipide Sphingosin-1-phosphat und Ceramid-1-phosphat lieferte wichtige Informationen über deren Gewebeverteilung und Veränderung während einer Ko-Infektion, was ebenfalls erstmalig untersucht wurde. In Artikel I werden die IAV-spezifischen Veränderungen von Oxylipinen im Schwein (Deutsche Landrasse), als Wirtsmodell, analysiert. Dazu wurden Proben infizierter Tiere zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion von Lunge, Milz, Blutplasma und bronchoalveolären Lavagen analysiert und mit Proben nicht-infizierter Tiere verglichen. Vor allem das Gewebe der Lunge und Milz zeigte eine Zunahme an Verbindungen, welche teilweise aus Infektionen von Menschen und Mäusen bekannt sind. Die Analyse unterschiedlicher Probenarten lieferte zudem einen Überblick über gut geeignetes Probenmaterial. Erstaunlicherweise zeigten sich viele Veränderungen in der Milz, welche selbst nicht infiziert war. Da sich die meisten Studien aufgrund der lokalen Wirkung der Lipidmediatoren auf Probentypen konzentrieren, die sich in unmittelbarer Nähe zur Infektion befinden, liefert diese Dissertation neue Einblicke und zeigt zudem eine Form der systemischen Wirtsantwort auf. Neben der Infektionen von Tieren mit einem komplexen Immunsystem bezieht sich Artikel II auf die Infektion von humanen Bronchialepithelzellen (16HBE) mit den Erregern S. aureus, S. pneumoniae und IAV, wobei sowohl Einzelinfektionen als auch bakteriell-virale Ko-Infektionen untersucht wurden. Da solche Zellen als initiale Barriere für Pathogene dienen und auch erste Angriffsfläche dieser sind, ist das Verständnis dieser Wirt-Pathogen-Interaktion von entscheidender Bedeutung. Die meisten Veränderungen zeigten sich bei einer Pneumokokken-Infektion. Zudem wurde deutlich, dass sich die untersuchten bakteriellen Infektionen von der viralen durch die verstärkte Synthese von 5-Hydroxyeicosatetraensäure (HETE) unterscheiden. Für die weiteren Infektionen wurden Mäuse als Infektionsmodell genutzt. Neben den untersuchten Infektionen mit Bezug zum Respirationstrakt wurde außerdem die Auswirkung einer S. pyogenes-Infektion in verschiedenen Mausstämmen analysiert und in Artikel III beschrieben. Infektionsbedingte Veränderungen von Prostaglandinen in geschwollenen Pfoten, welche beim Knochenumbau beteiligt sind, konnten ebenso beobachtet werden wie erhöhte Mengen an Sepsis- und Arthritis-assoziierten Lipidmediatoren, wenn der Infektion eine Arthritis vorangegangen war. Zudem wurden deutlich erhöhte Mengen an 20-HETE bei einer solchen schweren Infektion gemessen. Die gesteigerte Biosynthese von 20-HETE wurde in Artikel IV auch bei Infektionen mit dem hochpathogenen S. aureus LUG2012 bestätigt, wobei die Mengen dieses Eicosanoids in allen untersuchten Probentypen erhöht waren. In diesem letzten Artikel der vorliegenden Dissertation werden bakterielle und virale Infektionen ähnlich dem Ansatz in Artikel II beschrieben. Vor allem IAV-spezifische Veränderungen von Lipidmediatoren zeigten sich, die so auch in den Lungen und Milzen der Schweinen beobachtet werden konnten. Die zusätzlichen MALDI-MS-Imaging-Messungen ließen eine Akkumulation von Ceramid-1-phosphat in Milz und Lunge sowie eine Anreicherung in der roten Pulpa der Milz erkennen, welche bisher unbeschrieben ist. Insgesamt lieferten die Arbeiten zu dieser Dissertation umfangreiche Profile von Lipidmediatoren bei Infektionen dreier verschiedener Infektionsmodelle mit ausgewählten bakteriellen und viralen Pathogenen. Diese Daten können als Basis für weiterführende Projekte dienen, in denen der Einfluss einzelner bioaktiver Lipide auf den Infektionsverlauf genauer untersucht werden könnte.