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Improving biocatalysts via semi-rational protein design - Use of a multiple sequence alignment platform to reduce screening efforts and facilitate hit identification

  • The synthesis of valuable chemicals via traditional chemical methods can be often outperformed by the use of enzymes because of their excellent chemo-, regio- and stereoselectivity in aqueous solvents at ambient temperatures. On the other hand, enzymes often suffer from several limitations that hamper their industrial application. Protein engineering is commonly applied to overcome these limitations although the generation and the validation of mutants is often a laborious process that may not lead to the desired results within reasonable time frames. This thesis focuses on engineering the enantioselectivity and the substrate scope of industrially relevant enzymes, such as esterases and transaminases. Semi-rational protein engineering was employed to identify improved variants for the synthesis of valuable chemicals ensuring a reduced screening effort. Compared to previous works, 3DM’s applicability was extended to the study of correlated mutations and proved effective in the acceleration of the comprehension and in the mutation of these enzymatic scaffolds. Semi-rational approaches require an extensive amount of information such as protein structures, reaction mechanisms, previous mutational experiments reported in literature and a considerable amount of amino acid sequences from similar proteins to analyze amino acid distributions and correlated mutations. Here, we have exploited 3DM as a tool that can combine all this wealth of information: 3DM is a convenient solution to retrieve and integrate information simplifying decision making in the planning of a semi-rational mutant library since in 3DM’s multiple sequence alignments (MSA) is summarized Nature’s screening process for alternative variants. Furthermore, naturally evolving enzymes often require mutations at more than one position for the acquisition of a new property. Such mutations generate patterns that are recognized by the 3DM algorithm, which creates networks that can be investigated to design strategies that aim to improve the property of interest. Finally, these correlated mutations are connected to the mutations described in publications covered in the PubMed database, thus helping to investigate the role certain positions might play in the network. Article I shows that it is possible to improve the enantioselectivity of an esterase towards a highly symmetrical substrate while drastically reducing the screening effort. This was achieved through the creation of libraries that limit the variants to those identified in the 3DM alignment. Article II shows that networks of correlated mutations are composed of positions that may cluster around a function. These functions can be investigated because 3DM connects the positions in the network to their related publications. In this article, a mutant of the esterase PFE-I from Pseudomonas fluorescens was generated having increased enantioselectivity in the hydrolysis of important target compounds. Article III suggests that the in silico modelling software YASARA, combined with the use of the 3DM database, can further reduce the screening effort: it was possible to identify a hot-spot because both the 3DM database and YASARA docking studies, indicated its importance. This led to a further improved enantioselectivity of the enzyme variant identified in Article II. Article IV shows how MSA may be used to get structural insights into the catalytic properties of enzymes with documented activity. The study of the patterns observed in a large subfamily alignment allowed the definition of the structural determinants important for the substrate recognition in amine transaminases. Article V and VI apply the knowledge acquired for the improvement of the substrate scope in the amine transaminase from Vibrio fluvialis.
  • La sintesi di prodotti di chimica fine tramite metodi chimici tradizionali puo essere soppiantata dall uso di enzimi grazie alle loro eccellenti chemo, regio e stereoselettivita in solventi acquosi ed a temperatura ambiente. Sfortunatamente, l applicazione a livello industriale di enzimi e spesso ostacolata da numerose limitazioni. Per questo motivo, ingegneria proteica e comunemente applicata per risolvere queste limitazioni anche se la validazione dei mutanti cosi generati e spesso un processo laborioso che puo non generare i resultati desiderati in tempi ragionevoli. Questa tesi tratta della ingegnerizzazione della enantioselettivita e dello spettro di substrati accettati da enzimi di rilevanza industriale, quali esterasi e transaminasi. Ingegneria proteica semi-razionale e stata applicata per generare mutanti con migliori prestazioni nella sintesi di composti chimici di interesse industriale, garantendo una significativa riduzione della dimensione del campione di cloni analizzato per identificare i mutanti. Rispetto ai precedenti lavori, l applicazione del software 3DM e stata estesa allo studio di mutazioni concatenate ed e stata dimostrata efficace non solo nell acceleramento del processo di comprensione ma anche nella generazione di mutazioni su queste classi di enzimi. In genere, approcci di ingegneria proteica semi-razionale richiedono un estesa ricerca di informazioni come, per esempio, strutture cristalline, meccanismi di reazione, esperimenti mutazionali precedentemente riportati in letteratura e una considerevole somma di sequenze amminoacidiche provenienti da proteine simili per analizzare correttamente le distribuzioni amminoacidiche e le mutazioni concatenate. Nel presente lavoro e stato sfruttato 3DM poiche in grado di concentrare in una sola risorsa tutte queste informazioni: 3DM e una soluzione conveniente per raccogliere ed integrare dati, semplificando il processo decisionale durante la costruzione di una libreria di mutanti semi-razionale dato che all interno degli allineamenti multipli di sequenze di 3DM (multiple sequence alignment, MSA) viene riassunto il processo svolto dalla Natura per la selezione delle mutazioni possibili. Per di piu, per ottenere una nuova proprieta, in natura gli enzimi devono acquisire mutazioni a piu di una posizione simultaneamente. Questi eventi mutazionali generano dei motivi che vengono riconosciuti dall algoritmo in 3DM, il quale costruisce un network che puo essere studiato al fine di creare delle strategie che puntino al miglioramento delle proprietà di interesse. Infine, queste mutazioni concatenate sono collegate alle mutazioni descritte nelle pubblicazioni contenute nella banca-dati Pubmed, facilitando la comprensione del ruolo che certe posizioni giocano all interno del network. L Articolo I mostra che e possibile migliorare l enantioselettivita di un esterasi nella conversione di un substrato altamente simmetrico con una drastica riduzione del processo di selezione. Questo e stato ottenuto tramite la creazione di librerie che contengono solo varianti identificate tramite un allineamento di 3DM. L Articolo II mostra come i network di mutazioni concatenate si generino attorno a posizioni che sono rilevanti per una precisa proprieta enzimatica. Queste funzioni possono essere identificate perche 3DM collega le posizioni nel network con le relative pubblicazioni. In questo articolo, e stato generato un mutante della esterasi PFE-I di Pseudomonas fluorescens con una migliore enantioselettivita nella idrolisi di composti chimici con elevato valore industriale. L Articolo III suggerisce come il programma per simulazioni YASARA, in combinazione all uso della banca-dati 3DM, puo essere usato per ridurre ulteriormente il processo di selezione: la posizione cruciale per la modificazione delle proprieta enzimatiche e stata trovata quando sia YASARA e sia 3DM hanno evidenziato la sua importanza. Infatti, la generazione di una libreria di mutanti a questa posizione ha ulteriormente incrementato l enantioselettivita del mutante identificato nell Articolo II. L articolo IV mostra come un MSA possa essere utilizzato per ottenere delle indicazioni strutturali in base alle proprietà catalitiche descritte per enzimi anteriormente documentati. Lo studio di motivi osservati all interno di un allineamento di una grande sotto-famiglia enzimatica di amino transaminasi ha permesso la individuazione delle discriminanti strutturali necessarie per il riconoscimento del loro substrato naturale. Articoli V e VI applicano la conoscenza cosi ottenuta per migliorare lo spettro di substrati accettati della amino transaminasi di Vibrio fluvialis.

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Metadaten
Author: Alberto Nobili
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002620-7
Title Additional (German):Verbesserung von Biokatalysatoren mittels semi-rationalen Proteindesigns - Verwendung einer multiplen Sequenzalignment-Plattform zur Reduzierung des Screening-Aufwands und Vereinfachung der Hit-Identifizierung
Advisor:Prof. Dr. Uwe Bornscheuer
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2016/09/09
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2016/04/18
Release Date:2016/09/09
Tag:3DM
GND Keyword:Esterasen, Protein-Engineering, Transaminasen, gerichtete Evolution
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie