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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002449-6

Untersuchungen zur Acyltransferaseaktivität der Lipase A aus Candida antarctica

  • Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Synthese von Fettsäureestern aus Pflanzenölen mit Methanol bzw. Ethanol in Gegenwart von Wasser durch die Lipase CAL-A zu optimieren, wobei insbesondere die Bildung von freien Fettsäuren minimiert werden sollte. Zunächst wurde ein Hochdurchsatztest zur Bestimmung der Acyltransferaseaktivität der CAL-A etabliert, welcher auf der Abnahme des Alkoholgehalts in Umesterungsreaktionen basiert. Dabei zeigte sich eine gute Übereinstimmung zwischen den Umsätzen, die mit GC und dem Oxidase-Assay ermittelt wurden, wobei die Umsätze nicht zu gering sein sollten da sonst größere Schwankungen im Oxidase-Assay möglich sind. Durch das rationale Design anhand der gelösten Struktur der CAL-A konnten vier Mutagenesepositionen identifiziert werden: Thr118, Asp122, Thr221 und Glu370. Durch den Austausch der Aminosäurereste an diesen Positionen gegen hydrophobere Aminosäuren wurden 28 CAL-A Varianten generiert. Diese wurden für eine initiales, qualitatives Screening eingesetzt, indem drei CAL-A Varianten eine ähnliche bzw. erhöhte Esterbildung im Vergleich zum Wildtyp zu haben schienen. Die drei Varianten Thr118Ile, Asp122Leu und Thr221Ala wurden daraufhin für weitere Untersuchungen in P. pastoris im Bioreaktor hergestellt und in Biokatalysen verwendet. Eine erhöhte Esterbildung für die Varianten Thr118Ile und Thr221Ala ließ sich jedoch nicht bestätigen, allerdings zeigte sich, dass die CAL-A Variante Asp122Leu deutlich weniger freie Säure bildete als der CAL-A WT. In der anschließenden Charakterisierung von CAL-A Asp122Leu zeigte sich, dass diese Variante wie CAL-A WT auch thermostabil ist und dass beide Enzyme das gleiche pH- und Temperaturoptimum haben. Des Weiteren wurden CAL-A WT und Asp122Leu adsorptiv auf Lewatit VP OC 1600 immobilisiert und in Biokatalysen eingesetzt, in denen CAL-A Asp122Leu erneut deutlich weniger freie Säure bildete. Darüber hinaus wurde auch der Einfluss der Reaktionsbedingungen auf die Acyltransferaseaktivität der CAL-A untersucht. Es wurden dazu Biokatalysen mit Ethanol oder Methanol durchgeführt, in denen der Wassergehalt (5% oder 10% bezogen auf die Einwaage an Öl) und die Reaktionstemperatur (30°C, 40°C oder 50°C) variiert wurden. Die Biokatalysen mit Methanol zeigten dabei generell einen hohen Umsatz zwischen 85-95%, während die Biokatalysen mit Ethanol nur zu geringeren Umsätzen führten (55-85%). Allerdings zeigte sich in einem Langzeitstabilitätstest mit einer Biokatalysedauer von 97 h auch, dass Methanol das verwendete CAL-A Immobilisat stärker inaktiviert als Ethanol. Ebenso musste bei einem Wassergehalt von nur 5% die Methanolzugabe schrittweise erfolgen, um eine Inaktivierung des CAL-A Immobilisats zu verhindern. Somit konnte eine Optimierung der CAL A katalysierten Umesterungsreaktionen sowohl durch das Protein-Engineering des Biokatalysators als auch durch die Anpassung der Prozessbedingngen erreicht werden. Dabei wurden Erkenntnisse gewonnen, die auch zur Beurteilung der industriellen Anwendbarkeit eines solchen Prozesses beitragen können.
  • This work aimed for the optimisation of the CAL-A catalysed synthesis of fatty acid esters from plant oils and methanol or ethanol in the presence of water. One goal was the minimisation of free fatty acid formation during the process. Initially, an assay for high-throughput screening was established to determine the acyltransferase activity of CAL A. This oxidase assay was based on the decrease of alcohol in transesterification reactions and the results showed good agreement with measurements via GC. Although the conversions shouldn’t be too small because otherwise higher variations in the oxidase assay are possible. Based on a solved 3D structure of CAL-A, rational design was conducted to identify 4 promising mutagenesis positions: Thr118, Asp122, Thr221 and Glu370. The exchange of the amino acid residues at these positions with more hydrophobic ones led to 28 variants of CAL-A. They were used in an initial qualitative screening that left 3 variants with apparently similar or higher ester synthesis than the wild type. For further investigations these 3 variants were expressed in P. pastoris in a bioreactor and used in biocatalysis reactions. Compared to the wild type an enhanced ester synthesis for the variants Thr118Ile and Thr221Ala couldn’t be confirmed in these experiments, but the variant Asp122Leu showed a distinct decrease in free fatty acid formation. The Characterisation of CAL-A Asp122Leu showed that this enzyme is thermostable as CAL-A wild type and that both enzymes have a similar temperature and pH-optimum. In addition to that, CAL-A wild type and Asp122Leu were immobilised on Lewatit VP OC 1600 and subsequent biocatalysis experiments confirmed the former results that reactions with Asp122Leu produced fewer amounts of free fatty acids. Furthermore the influence of different reaction parameters on the acyltransferase activity of CAL-A was investigated. Biocatalysis reactions with methanol or ethanol were conducted varying the water content (5% or 10% based on the weight of oil) and the reaction temperature (30°C, 40°C or 50°C). Generally, reactions with methanol showed a higher conversion (85-95%) than the ones with ethanol (55-85%). However, long-term stability tests (biocatalysis for 97 h) showed that methanol inactivates the immobilisate of CAL-A stronger than ethanol does. Moreover the addition of methanol had to be done stepwise if a water content of 5% was applied to prevent inactivation of the CAL-A immobilisate. Conclusively, the optimisation of the CAL-A catalysed transesterification reactions was accomplished by both protein engineering and process optimisation. The gained results could help to evaluate the industrial applicability of such a process.

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Metadaten
Author: Janett Müller
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002449-6
Title Additional (English):Investigations of the Acyltransferase Activity of Lipase A from Candida antarctica
Advisor:Prof. Dr. Uwe Bornscheuer
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2016/02/17
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2015/12/02
Release Date:2016/02/17
GND Keyword:Biochemie, Biotechnologie, Enzym, Lipasen, Umesterung
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie