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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002118-7

Synthese von Nukleosidanaloga zur Funktionalisierung und Strukturaufklärung von RNA

  • Es wurden vier Nukleosid-Analoga hergestellt, deren Anwendungsbereiche gänzlich unterschiedlicher Natur sind. Sie stellen wichtige Hilfsmittel zur Erweiterung der Eigenschaften und zur Charakterisierung von Nukleinsäuren dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Voraussetzungen für die Selektion eines Cytidindesaminase-Ribozyms geschaffen. Es wurde ein Assay für die in-vitro-Selektion vorgestellt und das zu diesem Zweck notwendige Schlüsselmolekül, ein Cytidin-Derivat, designt und mit einer Gesamtausbeute von 8 % synthetisiert. Das Nukleosid wurde in einer 16-stufigen Synthese mit zwei unterschiedlichen Linkereinheiten funktionalisiert und stellt ein effektives Werkzeug zur Selektion von Cytidindesaminase-Ribozymen dar. Das bifunktionalisierte Cytidin-Substrat wurde über seine 5’-OH Gruppe mit einem Hexaethylenglykol-Linker versehen, der eine primäre Aminogruppe aufwies. Über eine kurze Linkereinheit an der C4-Position der Nukleobase wurde ein Biotinrest angefügt. Die angestrebte Selektionsstrategie sieht die Oxidation des 3’-Endes einer RNA-Bibliothek mittels Natriumperiodat vor. Das resultierende Dialdehyd soll anschließend mit der primären Aminogruppe des Cytidin-Derivats umgesetzt werden. Ein Protokoll zur Anbindung des synthetisierten Cytidins an eine an ihrem 3’-Terminus oxidierte RNA wurde entwickelt und steht für die zukünftige Selektion zur Verfügung. Der Nachweis des Konjugats aus RNA und dem Cytidin-Derivat erfolgte mittels HPLC, sowie massenspektrometrisch. Die RNA-Bibliothek zur Selektion eines Cytidindesaminase-Ribozyms wurde ausgehend von zwei Klenow-Primern hergestellt und steht ebenfalls bereit. Parallel zu den Arbeiten der Synthese des Cytidins, wurden im Rahmen zweier Kooperationen drei weitere Nukleosid-Analoga dargestellt. Das erste Kooperationsprojekt sah die Herstellung einer kurzen RNA vor. Es handelte sich dabei um die hochmodifizierte Anticodonschleife der tRNA(Lys) aus E. coli. Zur chemischen Festphasensynthese dieser 17mer RNA waren die Phosphoramiditbausteine von N6-Threonylcarbamoyladenosin (t6A) und 2-Thiouridin (s2U) erforderlich. Die Synthesen der Nukleosid-Analoga t6A und s2U, sowie deren Umwandlungen in die jeweiligen Phosphoramidite wurden vorgestellt. Die Darstellung von s2U erfolgte nach Protokollen von Vorbrüggen und Strehlke mit einer Gesamtausbeute von 78 %.Während des Schutzes der 2’-OH Gruppe mit TBDMS, bildete sich hauptsächlich das 3’-O-TBDMS-Isomer, das sich nur sehr schwer vom 2’-O-TBDMS-Isomer separieren ließ. Durch Verwendung der Schutzgruppe Di-tert-butylsilandiylditriflat zur Synthese des s2U-Phosphoramidits konnte das Problem der Bildung des 3’-O-TBDMS-Isomers behoben werden. Die erste Synthese eines t6A-Derivats orientierte sich an Vorschriften von Davis et al. und lieferte das Produkt mit einer Gesamtausbeute von 25 % über 7 Schritte. Darüber hinaus wurde eine zweite Synthesestrategie entworfen, die auf der Verwendung eines Isocyanats von L-Threonin basierte. Die Aminosäure Threonin wurde mit zwei verschiedenen Silylschutzgruppen versehen, die beide kompatibel mit der Phosphoramiditchemie während der chemischen RNA-Synthese waren. Das Isocyanat wurde mit guten Ausbeuten dargestellt und anschließend sowohl mit ungeschütztem, als auch mit geschütztem Adenosin zur Reaktion gebracht. In beiden Fällen wurde ein t6A-Derivat erhalten. Die Umsetzung mit einem geschützten Adenosin lieferte das t6A-Derivat mit einer Gesamtausbeute von 20% über 8 Stufen. Es wurde somit eine – in Bezug auf Ausbeute und Arbeitsaufwand – gleichwertige Alternativsynthese zur Darstellung von t6A-Derivaten entwickelt. Aus den beiden modifizierten Nukleosiden s2U und t6A wurden die Phosphoramidit-Bausteine generiert. Durch den erfolgreichen Einbau beider Nukleoside in eine 17mer RNA konnte die Anticodon-Schleife der tRNALys hergestellt werden. Die Bearbeitung des zweiten Kooperationsthemas erforderte die Herstellung eines isotopenmarkierten Pseudouridins. Es wurde eine vergleichende Synthese von 15N- markiertem Pseudouridin durch Adaption zweier unterschiedlicher Protokolle durchgeführt. Die erste Strategie, eine 7-stufige Synthese, lieferte die Zielverbindung mit einer Ausbeute von 2% über alle Schritte ausgehend von D-Ribose. Bezogen auf den 15N-Harnstoff betrug die Gesamtausbeute 14 %. Grund für die geringe Gesamtausbeute war eine unvermeidliche Isomerisierung der beta-Form der D-Ribose zum nicht reagierenden alpha-Anomer während der Lacton-Bildung, sowie der geringe Umsatz während der Reaktion mit dem 15N-angereicherten Harnstoff. Die zweite Strategie gab das 15N-markierte Pseudouridin mit einer Gesamtausbeute von 9 % über 9 Schritte. Für die Synthese von Uracil wurde eine alternative Vorschrift verwendet, bei der Propinsäure mit Harnstoff umgesetzt wurde. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass auf karzinogene Lösungsmittel, sowie anderer Reagenzien ohne Ausbeuteverluste verzichtet werden konnte.
  • This thesis describes the synthesis of modified nucleosides. Four nucleoside analogs were prepared, whose fields of application are of entirely different nature. They represent important tools for expanding the properties of nucleic acids, as well as the characterization of oligonucleotides. Within the scope of this work, the stage was set for the selection of a cytidine deaminase ribozyme. An assay for the in-vitro selection was presented, as well as the design and the 16-step synthesis of the required key molecule, a cytidine derivative. Two linker moieties of different lengths and functionality were attached to the nucleobase and to the ribose of cytidine, in order to facilitate coupling of the nucleoside to periodate-oxidized RNAs, and for linking the functionalized library to a surface. A 5’-O-coupled hexaethylene glycol linker carrying an aliphatic amino group allows 3’-terminal conjugation of cytidine to the molecules of an RNA library, whereas a biotinylated linker attached to C4 of cytosine allows linking of the modified library to a streptavindine coated surface. The suitability of the synthesized cytidine derivative for functionalization of RNAs was confirmed by successful conjugation to the 3’-terminus of a model RNA, as analyzed by HPLC and MALDI-MS. This set-up is going to be used for selection of a cytidine deaminase ribozyme supporting the conversion of uridine to cytidine. Furthermore, within the framework of two cooperative projects, three additional nucleoside analogs have been prepared. In the course of the first cooperative project, the short yet highly modified anticodon loop of tRNA(Lys) of E. coli has been synthesized. For this purpose, the phosphoramidite building blocks of N6-threonylcarbamoyladenosine (t6A) and 2-thiouridine (s2U) were produced. The preparation of s2U was achieved with a total yield of 78 %, following protocols of Vorbrüggen and Strehlke. The protection of the 2’-OH group with TBDMS-Cl/AgNO3 gave the 3’-O-TBDMS isomer as a major product. Since the separation of the 3’-O-TBDMS isomer from its 2’-O-TBDMS isomer was difficult and rather ineffective. By using the alternative protecting group di-tert-butylsilyl bis(trifluoromethanesulfonate), only the desired 2’-O-TBDMS protected nucleoside could be maintained. For synthesizing a t6A derivative, in a first approach protocols from Davis et al. have been modified, giving the t6A product with a total yield of 25 % over 7 steps. In addition to that, a second strategy was developed. In this case, a silyl-protected threonine was converted into its isocyanate with good yields. The reaction of the isocyanate with tris-O-acetyl adenosine gave the t6A derivative with a yield of 20 % over 8 steps. Thus, a comparable alternative strategy - in terms of yield and work load - for synthesizing t6A derivatives has been developed. After generating the phosphoramidites of s2U and t6A, both were incorporated into a short RNA using the automated solid phase synthesis. The successful incorporation of these two nucleoside analogs gave the highly modified anticodon loop of tRNA(Lys) . The second cooperative project required the synthesis of a 15N labeled pseudouridine. One strategy gave the C-nucleoside starting from D-ribose with a total yield of 2 % over 7 steps. Based on the 15N-urea, the yield was 14 %. This rather low yield is due to the unavoidable isomerization of the beta-form of D-ribose into the alpha-anomer during the formation of a lactone under alkaline conditions, as well as the low yield of the reaction between an enaminone with 15N-urea. The second strategy for synthesizing isotope labeled pseudouridine on the basis of Chow et al. gave pseudouridine with a total yield of 9 % over 9 steps. In contrast to the protocols of Chow, the synthesis of uracil was accomplished by the reaction between 15N-urea and propiolic acid. Furthermore, improvements could be achieved by omitting carcinogenic solvents and reagents without yield losses. [1,3-15N]-pseudouridine was transformed into a phosphoramidite precursor and thus can be subsequently incorporated into an RNA after consultation with the cooperation partner.

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Metadaten
Author: Nico Rublack
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002118-7
Title Additional (English):Synthesis of nucleoside analogues for functionalization and elucidation of RNA structures
Advisor:Prof. Dr. Sabine Müller
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2014/12/22
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2014/12/10
Release Date:2014/12/22
GND Keyword:Chemie, Cytidindesaminierung, Nukleosidanaloga, RNA
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie