• search hit 26 of 102
Back to Result List

Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002284-3

Structure– and sequence–function relationships in (S)-amine transaminases and related enzymes

  • Chiral primary amines are valuable building blocks for many biologically active compounds. Environmentally friendlier alternatives to the classical methods for α-chiral primary amine synthesis are highly desired. A biocatalytic alternative that recently proved beneficial for industrial applications is asymmetric synthesis utilising (S)-selective amine transaminases (S-ATAs). These enzymes can be utilized to transaminate a prochiral ketone with an amino donor (e.g. isopropylamine), to achieve a chiral amine and a carbonyl product (e.g. acetone). However, for several potential applications protein engineering is required to fit (S)-ATAS to the demands of an industrial process. Since no (S)-ATA crystal structure required for understanding the substrate recognition and thus protein engineering was available, we first aimed at obtaining structural data. Instead of solving crystal structures ourselves, we took advantage of structural genomics projects and discovered, that the protein data bank (PDB) already contained crystal structures of four enzymes with unknown function that we hypothesised to possess (S)-ATA activity. After developing a screening method, the four enzymes could be characterized as ω-amino acid:pyruvate transaminases (ωAA:pyr TAs). (S)-amine conversion was suggested to be a ‘substrate-promiscuous’ activity of these enzymes, as it is pronounced differently in the four investigated ones. By comparing the active sites of the highly and poorly active (S)-ATAs, the residues that determine the ability of amine conversion in these enzymes were discovered. Furthermore, the mechanism for dual substrate recognition, the binding of both, carboxyl and bulky hydrophobic substrates in the same active site, could be elucidated with the crystal structures. A flexible arginine side chain is able to adopt various positions thus enabling carboxylate binding and by ‘flipping’ out of the active site, to create space for amine binding. Then, a limitation of these enzymes, the restricted substrate scope caused by a small binding pocket was addressed. First, a rational protein engineering approach was set up to create more space. The tested mutations, however, destroyed most of the activity for both regular and more bulky substrates. We thus learned that the structural requirements for (S)-ATA activity are more complex than initially anticipated and a semi-rational approach was applied to broaden the substrate scope. By systematic saturation of active site positions, substantially improved mutants for bulkier amine synthesis could be obtained. As this study highlighted a lack of understanding of (S)-ATA, the functional important residues in the enzymes belonging to the class III TA family were surveyed. This family is defined by common sequence and structure features and besides (S)-ATAs mainly comprises TAs of various substrate scopes but also a few phospholyases, racemases and decarboxylases. To enable the comparison of active site residues among them, a commercial bioinformatics tool was used to create a family wide structure-based alignment of around 13,000 sequences. Based on statistical analyses of this alignment, structural inspections and literature evaluation, active site residues crucial for certain specificities within this family have been identified. By investigating the ingenious active site designs that enable such a plethora of reactions, and by identifying sets of functional important residues termed ‘active site fingerprints’, the understanding of catalysis in this enzyme family could be broadened. Furthermore, these functional important residues can on the one hand be applied to predict the specificity of uncharacterised enzymes, if a fingerprint is matched. On the other hand, if no fingerprint is matched, they can help to discover yet unknown activities or mechanisms to achieve a known specificity. We exemplified the latter case by functionally characterising a Bacillus anthracis enzyme with the crystal structure 3N5M, whose substrate specificity was unknown and could not be predicted. The 3N5M enzyme was found to possess ωAA:pyr TA and (S)-ATA activity even though it lacks the above-mentioned ‘flipping’ arginine. Based on molecular dynamics simulations we were able to propose an alternative mechanism for dual substrate recognition in the B. anthracis ωAA:pyr TA. By these findings the understanding of the requirements for (S)-ATA activity could be further broadened and a functional knowledge gap within the class III TA family was closed. The active site residue composition in 3N5M is now connected to enzymatic function and may be applied for future specificity predictions.
  • Chirale primäre Amine sind Synthons für eine Vielzahl an biologisch aktiven Substanzen. Für die Synthese von α-chiralen primären Aminen werden dringend umweltfreundlichere Alternativen zu den klassischen chemischen Methoden benötigt. Eine biokatalytische Alternative ist die asymmetrische Synthese mittels (S)-selektiven Amintransaminasen ((S)-ATAs). Diese Enzyme können verwendet werden um ein prochirales Keton mit einem Aminodonor (z.B. Isopropylamin) zum gewünschten Aminprodukt und einem Carbonylprodukt (z.B. Aceton) zu transaminieren. Um jedoch den industriellen Prozessansprüchen gerecht werden zu können, wäre in vielen Fällen protein engineering nötig. Allerdings war weder eine Kristallstruktur publiziert noch die Substratbindung ausreichend verstanden um protein engineering zu erlauben, weshalb zuerst Stukturdaten benötigt wurden. Anstatt Kristallstrukturen selbst zu lösen, profitierten wir von structural genomics Projekten fanden heraus, dass die Proteindatenbank (PDB) bereits Strukturen von vier Enzymen unbekannter Funktion enthielt, für die wir annahmen, dass sie (S)-ATA Aktivität aufweisen. Nach der Entwicklung einer screening Methode, wurden diese Enzyme als ω-Aminosäure:Pyruvat Transaminasen (ωAS:Pyr TA) charakterisiert. Der Umsatz von (S)-Aminen ist vermutlich eine Form der „Substrat-Promiskuität“ dieser Enzyme, da sie in den vier Enzymen unterschiedlich ausgeprägt ist. Durch den Vergleich der aktiven Zentren der (S)-ATAs mit hoher und der mit niedriger Aktivität, konnten die AS identifiziert werden, die den Aminumsatz ermöglichen. Des Weiteren konnte der Mechanismus der dualen Substraterkennung, die Bindung von sowohl Carbonsäuren als auch sperrigen hydrophoben Substraten im selben aktiven Zentrum mit Hilfe der Strukturen aufgeklärt werden. Eine flexible Arginin Seitenkette kann verschiedene Konformationen einnehmen um sowohl Carboxylgruppen zu koordinieren, als auch aus dem aktiven Zentrum heraus zu „flippen“ um Platz für die Bindung der hydrophoben Substrate zu schaffen. Um der Limitierung dieser TAs, des eingeschränkten Substratspektrums aufgrund einer kleinen Bindetasche zu begegnen, wurde ein rationaler protein engineering Ansatz verfolgt. Alle untersuchten Mutanten wiesen jedoch sowohl für die normalen, als auch für sperrigere Substrate kaum noch Aktivität auf. Wir haben somit gelernt, dass die strukturellen Voraussetzungen für (S)-ATA Aktivität komplexer sind als zunächst angenommen. Ein semi-rationaler Ansatz führte schließlich durch die systematische Sättigung von Positionen im aktiven Zentrum zu Mutanten mit deutlich höherer Aktivität gegenüber sperrigeren Substraten. Da diese Studie ein mangelndes Verständnis dieser Enzyme aufzeigte, wurden die funktionell wichtigen AS in der gesamten Klasse III TA Familie, welche die (S)-ATAs enthält, untersucht. Zu dieser, auf Sequenz- und Strukturmerkmalen basierende Familie, zählen weiterhin TAs verschiedenster Substratspezifitäten aber auch einige Phospholyasen, Racemasen und Decarboxylasen. Um den Vergleich von AS der aktiven Zentren dieser Enzyme untereinander zu ermöglichen, wurde ein kommerzielles bioinformatisches Werkzeug verwendet um ein strukturbasiertes alignment von etwa 13.000 Sequenzen zu erstellen. Mittels statistischer Analysen dieses alignments, Vergleichen von Kristallstrukturen und Literaturrecherche konnten die Reste des aktiven Zentrums ermittelt werden, die für bestimmte Spezifitäten innerhalb dieser Familie notwendig sind. Durch die Untersuchung des verschiedenartigen Aufbaus der aktiven Zentren der solch eine Vielzahl an verschiedenen Reaktionen erlaubt und durch das Identifizieren der funktionell wichtigen AS, der sogenannten „Fingerabdrücke“ konnte das Verständnis der Katalyse in dieser Familie deutlich erweitert werden. Die funktionell wichtigen Reste können einerseits eingesetzt werden um die Funktion von uncharakterisierten Enzymen vorherzusagen wenn eine Übereinstimmung mit dem „Fingerabdruck“ vorhanden ist. Andererseits können sie benutzt werden, um Enzyme mit neuen Spezifitäten oder anderen Gestaltungen des aktiven Zentrums für eine bereits bekannte Spezifitäten zu identifizieren, wenn keine Übereinstimmung gefunden wurde. Letzteres wurde beispielhaft gezeigt durch die Charaterisierung des Bacillus anthracis Enzyms mit der Kristallstruktur 3N5M dessen Substratspezifität unbekannt war und nicht vorhergesagt werden konnte. Das Enzym stellte sich als ωAS:Pyr TA und (S)-ATA heraus obwohl es nicht das, oben genannte, „flippende“ Arginin enthält. Mittels moleküldynamischer Rechnungen konnte ein alternativer Mechanismus für die duale Substraterkennung in dieser TA vorgeschlagen werden. Durch diese Erkenntnisse konnte das Verständnis der Voraussetzungen für (S)-ATA Aktivität deutlich erweitert und eine Wissenslücke innerhalbe der Klasse III TAs geschlossen werden. Der Aufbau des aktiven Zentrums von 3N5M ist jetzt mit einer enzymatischen Funktion verknüpft und kann für zukünftige Funktionsvorhersagen verwendet werden.

Download full text files

Export metadata

Additional Services

Share in Twitter Search Google Scholar
Metadaten
Author: Fabian Steffen-Munsberg
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002284-3
Title Additional (English):-
Title Additional (German):Struktur– und Sequenz–Funktionsbeziehungen in (S)-Amintransaminasen und verwandten Enzymen
Advisor:Prof. Dr. Uwe Bornscheuer
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2015/07/23
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2015/06/05
Release Date:2015/07/23
GND Keyword:Annotation, Biokatalyse, Kristallstruktur, Proteindesign, Proteinsequenz, Transaminasen
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie