• search hit 4 of 13
Back to Result List

Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002169-2

Protein-Engineering von Enzymen des Hydantoinase-Prozesses

  • Carbamoylasen und Hydantoinasen werden im „Hydantoinase-Prozess“ großindustriell zur Synthese enantiomerenreiner Aminosäuren eingesetzt. Durch Verwendung einer Hydantoin-Racemase kann eine Ausbeute von theoretisch 100 % erreicht werden. In dieser Arbeit wurde untersucht, wie die beteiligten Enzyme mittels Protein-Design, an neue Substrate angepasst werden können. Dabei wurde die Carbamoylase aus A. aurescens einem gene-shuffling mit den eng verwandten beta-Ureidopropionasen aus S. kluyveri und A. tumefaciens unterzogen. Weiterhin wurde ein durch Dockingexperimente gestütztes rationales Design durchgeführt und auf dieser Basis gezielte Mutationen im aktiven Zentrum der Carbamoylase eingebracht, sowie fokussierte Bibliotheken des aktiven Zentrums erzeugt. Es konnte die Akzeptanz von β-Aminosäurederivaten als Substrat in dieser Carbamoylase erreicht werden. Das aktive Zentrum einer Hydantoinase aus Ochrobactrum spec. wurde ebenfalls mittels rationalem Design vergrößert um eine Akzeptanz von 5,5-disubstituierten Hydantoinen zu ermöglichen. Die Aktivitätsmessung gegenüber den neuen Substraten wurde in einem mehrstufigen Assaysystem durchgeführt. Dieses System basierte auf einem auf Ammoniummangel beruhenden Wachstumsassay, einem NADH Assay mit Glutamat-Dehydrogenase als Kopplungsenzym, sowie auf direktem HPLC Nachweis.
  • Carbamoylases and hydantoinases are industrially used in the “hydantoinase-process“ for synthesis of enantiopure amino acids. Using a hydantoin-racemase enables a theoretical yield of 100%. This thesis aimed at the protein-engineering of the partaking enzymes in order to allow for new substrates. The carbamoylase from A. aurescens was used in a gene-shuffling experiment with the closely related beta-ureidopropionases from S. kluyveri and A. tumefaciens. Furthermore rational design based on docking experiments was performed. Based on this targeted mutations as well as focused libraries were created in the carbamoylases active site. The acceptance of β-amino acid derivatives could be achieved. The active site of a hydantoinase from Ochrobactrum spec. was enlarged using rational design in order to achieve reactivity towards 5,5-disubstituted hydantoins. Activity was monitored used a multi-step assay system. This system was based on a growth assay relying on ammonia-starvation, an NADH-assay with glutamate-dehydrogenase as coupling enzyme and direct HPLC detection.

Download full text files

Export metadata

Additional Services

Share in Twitter Search Google Scholar
Metadaten
Author: Geoffrey A. Behrens
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002169-2
Title Additional (English):Protein-Engineering of enzymes of the Hydantoinase-Prozesses
Advisor:Prof. Dr. Uwe Bornscheuer
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2015/03/06
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2014/10/20
Release Date:2015/03/06
Tag:Carbamoylase, Hydantoinase-Prozess, Selektionsassay
carbamoylase, hydantoinase, hydantoinase-process, protein-engineering, selection-assay
GND Keyword:Dihydropyrimidinase, Molekulardesign, Proteindesign
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie
MSC-Classification:92-XX BIOLOGY AND OTHER NATURAL SCIENCES / 92Cxx Physiological, cellular and medical topics / 92C40 Biochemistry, molecular biology