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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001164-6

Protein Engineering und Anwendung von Enzymen mit α/β-Hydrolasefaltung

  • In ersten Teil der Arbeit wurde versucht, in einer α/β-Hydrolase (Esterase) durch den Austausch einzelner Aminosäuren die Aktivität eines anderen Mitgliedes zu erzeugen (Haloalkan-Dehalogenase (HLD)). Als Modellenzym diente die Arylesterase PFE aus Pseudomonas fluorescens, welche wie die HLDs eine cap-Domäne aus &alhpa;-Helices aufweist. Bei den HLDs wurde sich an den Unterfamilien HLD-I und II orientiert, deren Mitglieder Unterschiede in ihren katalytischen Triaden und in einigen weiteren, an der Katalyse beteiligten Aminosäuren zeigen. Sie katalysieren jedoch die gleiche Reaktion und unterscheiden sich nicht in ihrem Mechanismus. Mit Hilfe von Sequenz- und Strukturalignments einiger HLDs und der PFE wurde nach konservierten Bereichen innerhalb der HLDs gesucht. Neben der katalytischen Triade mussten die für HLD-Aktivität essenziellen Halogen-stabilisierenden Reste in der PFE eingefügt werden. Sowohl in der katalytischen Triade als auch bei den Halogen-stabilisier enden Resten gibt es Unterschiede zwischen den Unterfamilien HLD-I und HLD-II, woraus sich zwei unterschiedliche Sätze von hotspots ergaben. Mit Hilfe der error-prone PCR wurden auf Basis einer einfachen Mutante 4.000 Varianten erstellt und analysiert. Ein weiterer Ansatz zur Generierung von HLD-Aktivität beruhte auf einer Sättigungsmutagenese der Halogen-stabilisierenden Reste. Insgesamt wurden in diesem Experiment 765 Varianten erstellt und untersucht. Keine der mittels rationalem Design und gerichteter Evolution entwickelten Mutanten zeigte Aktivität. Das Fehlen von HLD-Aktivität liegt vermutlich im variabelsten Teil der HLDs begründet: dem loop nach dem β6-Strang. Die Aminosäuren aus diesem loop sind an der Bildung der Tunnel zum aktiven Zentrum beteiligt und haben Einfluss auf die Positionierung der Reste in der α4-Helix, welche z.T. das aktive Zentrum dieser Enzyme bilden. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Entwicklung eines enzymatischen Verfahrens zum Abbau von 3-Chlor-1,2-Propandiol (3-MCPD) und seinen Estern, welche in Lebensmitteln bei deren Herstellung entsehen können. Das Verfahren basiert auf einer Enzymkaskade aus Lipase, Haloalkohol-Dehalogenase (HHD) und Epoxydhydrolase (EH). Die Lipase setzt zunächst den Ester um und somit das 3-MCPD frei, welches im nächsten Schritt von der HHD zu Glycidol umgesetzt wird. Das ebenfalls toxische Glycidol wird schließlich durch eine EH zum nicht-toxischen Glycerin hydrolisiert. Im konkreten Fall wurden die Lipase A aus Candida antarctica (CAL-A), die HHD HheA aus Arthrobacter sp. AD2 und die EH EchA aus Agrobacterium radiobacter AD1 verwendet. Als Fettsäurekomponente für die Umsätze mit einem 3-MCPD-Ester wurde die Ölsäure gewählt. Im wässrigen System konnten innerhalb von 3,5 h 75% des 3-MCPD umgesetzt werden, wobei nach Beendigung der Reaktion das Zwischenprodukt Glycidol nicht mehr detektiert werden konnte. Im 2-Phasen-System mit dem 3-MCPD-Ölsäureester als Substrat war die Lipase CAL-A in der Lage, den Ester nahezu quantitativ aus dem Reaktionsgemisch zu entfernen und die entsprechenden Mengen an 3-MCPD freizusetzen, welches dann in der wässrigen Phase durch die HHD und die EH umgesetzt wurde. Dabei konnte der Wassergehalt im System ohne Einbußen in der Effektivität bis auf 5% gesenkt werden. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde eine neue HLD (DppA) aus Plesiocystis pacifica SIR-1 identifiziert und charakterisiert. Sequenz- und Strukturanalysen erlaubten die Einordnung des Proteins in die HLD-Unterfamilie I. Nach Untersuchung der Substratspezifität von DppA wurde das Enzym der Spezifitätsgruppe SSG-I zugeordnet. Im Unterschied zu den anderen Mitgliedern dieser Gruppe setzte DppA allerdings keines der getesteten chlorierten Substrate um. Bei der Suche nach strukturellen Erklärungen für diese Tatsache fiel eine Lücke im Sequenzalignment von DppA und dessen nächsten Verwandten DhlA auf. DppA fehlt hier ein Bereich von 11 Aminosäuren. Der Bereich liegt in der cap-Domäne und es wurde postuliert, dass das betreffende Segment sich durch die Anpassung eines Vorfahren heutiger Dehalogenasen an das Substrat 1,2-Dichlorethan entwickelte. In einer darauffolgenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass DhlA nach Entfernen einer Kopie der Sequenzwiederholungen nicht mehr in der Lage war, sein natürliches Substrat 1,2-Dichlorethan umzusetzen, dafür aber immer noch Aktivität gegenüber 1,2-Dibromethan zeigte. Die Aminosäurereste der Wiederholungen in DhlA haben Einfluss auf die Positionierung sowohl von Tunneln als auch von Resten im aktiven Zentrum. Ein Alignment der Strukturen von DhlA und DppA zeigte, dass ein Teil der Sequenz die Postion des slot-Tunnels aus DppA blockiert. Dementsprechend befindet sich dieser Tunnel in DhlA auch an anderer Stelle. Dem Enzym fehlen die mit der Fähigkeit zur Umsetzung von 1,2-Dichlorethan in Verbindung gebrachten Sequenzwiederholungen und dementsprechend setzt es insbesondere dieses Substrat nicht um.
  • In the first part of this work, an α/β-hydrolase was to be engineered by exchanging several amino acids to produce haloalkane dehalogenase (HLD) activity. As model enzyme served the aryl esterase PFE from Pseudomonas fluorescens, whose cap-domain consists, like those from HLDs, of α-Helices. In case of the HLDs the subfamilies HLD-I and HLD-II were used. Their members differ in their catalytic triads and in some other residues that participate in the catalytic reaction. On the other hand they catalyze the same reaction and do not differ in their catalytic mechanisms. With the help of sequence and structure alignments of PFE and some HLDs conserved regions within the HLDs were identified. For generating HLD activity, the essential halide-stabilizing residues apart from the catalytic triad had to be introduced in PFE. Subfamilies HLD-I and HLD-II show differences in the catalytic triad as well as in the halide-stabilizing residues, which resulted in different s ets of hotpots. On the basis of a simple mutant, 4.000 mutants were generated and analyzed with the help of error-prone PCR. Another approach for generating HLD activity was based on a saturation mutagenesis at the halide-stabilizing residues, where another 765 variants were created. None of the mutants generated neither by rational design nor by directed evolution showed any activity. The reason for the problems in creating HLD activity is probably found in the most variable part of the HLDs: the loop after the β6-strand. Amino acids from this loop participate in formation of the different access tunnels to the active site and also have some influence on the positioning of the α4-Helix, which forms in part the active site. The second part of this work dealt with the development of an enzymatic process for the degradation of 3-Chloro-1,2-propanediol (3-MCPD) and its esters, which can be formed during food processing. The process is based on an enzymatic cascade of a lipase, a haloalcohol dehalogenase (HHD) and an epoxide hydrolase (EH). The lipase converts the ester and releases the 3-MCPD, which is in turn converted by the HHD to glycidol. Finally, the toxic glycidol is hydrolyzed to the non-toxic glycerol. The enzymes applied were lipase A from Candida antarctica (CAL-A), the HHD HheA from Arthrobacter sp. AD2 and the EH EchA from Agrobacterium radiobacter AD1. As fatty acid for conversions of the 3-MCPD ester oleic acid was chosen. After 3.5 h, 75% of the 3-MCPD could be converted in the aqueous system, where after stopping the reaction the intermediate glycidol could not be detected anymore. In the 2-phase-system with the 3-MCPD ester as substrate, CAL-A was able to convert nearly quantitati vely and release the corresponding amounts of 3-MCPD, which was subsequently hydrolyzed by the HHD and the EH. The amount of water of the system in these experiments could be reduced down to 5% without a loss in efficiency. In the last part of this work a new HLD (DppA) from Plesiocystis pacifica SIR-1 was identified and characterized. Sequence and structure alignments were used to classify the enzyme as member of the subfamily HLD-I. According to the substrate profile of DppA it belongs to the substrate specificity group SSG-I. In contrast to other members of this group, DppA did not convert any of the tested chlorinated substrates. Analysis of the sequence revealed a gap in the alignment of DppA and its closest relative DppA, where DppA lacks 11 amino acids. The gap is part of the cap-domain and it was postulated, that this segment developed from an acestor of todays HLDs during adaptation to the substrate 1,2-dichloro-ethane (DCE). In a subsequent work it was shown, that after removal of one copy of the repeats DhlA had lost its activity towards DCE, but still was active towards 1,2-dibromo-ethane. These amino acids have influence on the positioning of tunnels as well as active site residues. An alignment of the structures from DppA and DhlA revealed, that some of these residues block the slot tunnel in DppA, which results in the tunnel in DhlA in being in a different place. DppA lacks the sequence repeats which were postulated to be responsible for the ability to convert 1,2-dichloro-ethan. Consequently, DppA does not convert this substrate.

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Metadaten
Author: Martin Hesseler
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001164-6
Title Additional (English):Protein Engineering and Application of Enyzmes with the α/β-Hydrolase Fold
Advisor:Prof. Dr. Uwe Bornscheuer
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2012/01/31
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2011/10/11
Release Date:2012/01/31
Tag:Haloalkan Dehalogenase, Plesiocystis pacifica
GND Keyword:Biokonversion, Proteindesign
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie