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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000823-0

Protein engineering of a Pseudomonas fluorescens esterase - Alteration of substrate specificity and stereoselectivity

  • The aim of this thesis was to validate a method called OSCARR for One-pot, Simple Cassette Randomization and Recombination for focused directed evolution, which had been developed by Dr. Hidalgo. It is based upon the megaprimer PCR method using outer primers differing in TM and including asymmetric cycles before the addition of the forward primer to generate more mutated megaprimer. As mutation-carrying primers, spiked oligonucleotides are employed. These spiked oligonucleotides are designed using an algorithm and have strictly defined composition of nucleotides at each position. An OSCARR library of the Pseudomonas fluorescens esterase I (PFE I) of approximately 8000 clones was generated and screened for altered chain-length selectivity. Two mutants with higher activity towards medium chain length p-nitrophenyl esters were identified, both carried the mutation F126I, which causes the substrate entrance tunnel to be widened, thus facilitating access of bulkier substrates to the active site. One mutant carried the additional mutation G120S which completes a catalytic tetrad which is observed mainly in proteases. F126I had a stronger influence on chain-length specificity, so the further amino acids which form the “bottleneck” to the active site were mutated to further widen the entrance, and mutants with improved activity were found. The bottleneck mutants which consist of single, double, triple and quadruple mutants which are mostly combinations of F126L, F144L, F159L and I225L were then assayed for altered enantioselectivity against chiral acids and secondary alcohols. For substrates 1-phenyl-1-propyl acetate (2), 1-phenyl-2-propyl acetate (3) and 1-phenyl ethyl acetate (4), mutants with increased enantioselectivity were found. I225L plays a crucial role, as it is vital for enantioselectivity against 3, but destroys selectivity against 2, both facts obvious from the comparison of the triple mutant without I225L (mutant T3) and the corresponding quadruple mutant including I225L (mutant Q). However, the single mutant I225L alone does not possess high selectivity against 3, so synergistic effects play an important role. The PFE I wild type already possesses a good enantioselectivity in the hydrolysis of 4, but all mutants which were analyzed in detail surpass the wild type. The program YASARA was then used to calculate docking solutions for both enantiomers of 2 and 3 into the wild type and the best mutant. The results revealed that the mutants’ widened bottleneck allows the phenyl moiety of the substrates to point towards the access tunnel, while only (R)-2 does so in the wild type. Residues 126 and 144 do not come very close to the substrate and are more likely to influence substrate diffusion. Another goal was to find a way to confer promiscuous amidase activity upon the PFE I. In the search for structural homologues, a close structural neighbour with amidase activity was found. The --lactamase from Aureobacterium sp. was named after its activity toward the Vince lactam 2-azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-one. Biocatalysis experiments with the PFE I and its mutants revealed an excellent enantioselectivity against the ( )-lactam. Specific activities were determined for purified proteins, and the activity of some mutants was within the same order of magnitude as lactamase’s activity.
  • Das Ziel dieser Arbeit war die Validierung der OSCARR Methode (One-pot, simple cassette randomization and recombination) für fokussierte gerichtete Evolution, die von Dr. Hidalgo entwickelt wurde. Sie basiert auf der Megaprimer PCR, die äußeren Primer besitzen unterschiedliche Schmelztemperaturen und asymmetrische Zyklen vor der Zugabe des Vorwärtsprimers dienen der Unterdrückung von Wildtyp-Amplifikation. Als mutagene primer dienen sogenannte spiked oligonukleotide, die mit Hilfe eines Algorithmus entworfen werden und strikt definierte Nukleotidzusammensetzungen an jeder Position aufweisen. Eine OSCARR Bibliothek der Pseudomonas fluorescens esterase I (PFE I) mit ca. 8000 Klonen wurde angelegt und auf veränderte Kettenlängenspezifität überprüft. Zwei Mutanten mit erhöhter Aktivität gegenüber mittelkettigen p-Nitrophenylestern wurden identifiziert, die beide die Mutation F126I tragen. Durch diese Mutation wird der Substrattunnel erweitert, wodurch größeren Substraten der Zugang zum aktiven Zentrum erleichtert wird. Eine Mutante trug die zusätzliche Mutation G120S, die eine katalytische Tetrade vervollständigt, wie sie in Serinproteasen vorliegt. F126 beeinflusst die Kettenlängenspezifität allerdings stärker, so dass weitere Aminosäuren des Substrattunnels („bottleneck“) mutiert wurden, um die Öffnung weiter zu vergrößern. Es wurden Einfach-, Doppel-, Dreifach- und Vierfachmutanten generiert, die vor allem Kombinationen aus F126L, F144L, F159L und I225L sind. Diese Mutanten wurden dann auf veränderte Enantioselektivität gegenüber chiralen Säuren und Alkoholen überprüft. Für die Substrate 1-Phenyl-1-propylacetat (2), 1-Phenyl-2-propylacetat (3) und 1-Phenyl-1-ethylacetat (4) wurden Mutanten mit erhöhter Enantioselektivität gefunden. I225L spielt eine wichtige Rolle, da es unabdingbar für die Enantioselektivität gegenüber 3 ist, während es die selektivität gegenüber 2 zerstört, was durch Vergleich der Dreifachmutante ohne I225L mit der Vierfachmutante offensichtlich wird. Die Einfachmutante I225L ist allerdings weniger selektiv gegenüber 3 als der Wildtyp, synergistische Effekte zwischen Mutationen sind also von großer Wichtigkeit. Der PFE I Wildtyp besitzt bereits eine gute Enantioselektivität gegenüber 4, aber alle analysierten Mutanten übertreffen den Wildtyp deutlich. Mit Hilfe des Programms YASARA wurden Dockings für beide Enantiomere von 2 und 3 in den PFE I Wildtyp und die jeweils beste Mutante durchgeführt. Durch die Erweiterung können die Substrate im Wildtyp ihren Phenylring immer in Richtung des Tunnels orientieren, dies ist im Wildtyp nur für (R)-2 möglich. Die Reste 126 und 144 sind relativ weit vom Substrat entfernt und beeinflussen vermutlich die Diffusion. Weiterhin sollte promiskuitive Amidase-Aktivität in der PFE I hervorgerufen werden. Auf der Suche nach strukturell homologen Enzymen mit Amidase-Aktivität fand sich die --Lactamase aus Aureobacterium sp., die nach ihrer Aktivität gegenüber dem Vince Lactam 2-Azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-on benannt wurde. Biokatalysen mit der PFE I und einigen Mutanten zeigen exzellente Selektivität gegenüber dem (-)-lactam. Die spezifischen Aktivitäten einiger aufgereinigter Enzyme wurden bestimmt, die Aktivität einiger Mutanten lag in der selben Größenordnung wie die Aktivität der Lactamase.

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Metadaten
Author: Anna Schließmann
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000823-0
Title Additional (German):Protein engineering einer Pseudomonas fluorescens Esterase - Änderung von Substratspezifität und Stereoselektivität
Advisor:Prof. Dr. Uwe Bornscheuer
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2010/07/30
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2010/07/27
Release Date:2010/07/30
Tag:gamma-Lactamase
gamma-lactamase
GND Keyword:Arylesterase, Enantioselektivität, Gerichtete Evolution, Proteindesign, Substratspezifität
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie