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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000329-5

Qualitative und quantitative massenspektrometrische Analyse von Virionen des Pseudorabies Virus

  • Das Ziel dieser Arbeit war die qualitative und quantitative Analyse der Zusammensetzung von Partikeln des Pseudorabies Virus (PrV), des Erregers der Aujeszky’schen Krankheit beim Schwein. In Partikeln des PrV-Virusstammes Kaplan wurden nach ein- oder zweidimensionaler Elektrophorese und Identifizierung durch peptide mass fingerprint 27 Strukturproteine viraler und vier Strukturproteine zellulärer Herkunft (Annexin I und -II, HSP70 und Aktin) identifiziert. Die viralen Strukturproteine pUL37, pUL48, pUL18, pUL19, pUL29 (gB) und alle Strukturproteine zellulärer Herkunft wurden nach zweidimensionaler Elektrophorese in mehreren Isoformen nachgewiesen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Zusammensetzung von Deletionsmutanten des PrV mit derjenigen von Wildtyp-Virionen verglichen. Ziel war hier die Analyse von Veränderungen in der Partikelzusammensetzung über den Verlust des deletierten Proteins hinaus, z.B. als Folge einer dadurch nicht mehr möglichen Protein-Protein-Wechselwirkung oder einer abweichenden Morphogenese. Im Vordergrund stand dabei die Untersuchung der Tegumentproteine, da diese in eine Vielzahl von Protein-Protein-Interaktionen einbezogen sind und ihnen eine entscheidende Rolle während der Virusmorphogenese zukommt. Die quantitative Analyse von Mutanten mit Deletionen der Tegumentproteine pUS3, pUL11, pUL13, pUL16, pUL21, pUL35, pUL41, pUL43, pUL47, pUL49, pUL51, sowie der Deletion eines C-terminalen Fragments des UL36-Gens und des Glykoproteins E erfolgte massenspektrometrisch mit der SILAC Strategie. Nach Untersuchung der Strukturproteinprofile von allen oben genannten Deletionsmutanten lässt sich über die genannten Details hinaus generell folgendes feststellen: (1) Kapsid- beziehungsweise kapsid-assoziierte Proteine (pUL18, pUL25, pUL35 und pUL38) werden in stöchiometrischen Mengen zum Hauptkapsidprotein MCP142 (pUL19) in die Viruspartikel eingebaut. Diese Stöchiometrie war robust gegen alle untersuchten Deletionen. (2) Größere Flexibilität beim Einbau in das reife Virion zeigten Komponenten des Teguments. Kapsidnahe Tegumentproteine wie das pUL36 wurden meist stöchiometisch eingebaut. Größere Schwankungen beim Einbau in die verschiedenen untersuchten Deletionsmutanten zeigten die Tegumentproteine pUL11, pUL16, pUL21, pUL46, pUL48, pUL49 und pUS3. Deletionen in einzelnen Tegumentproteinen führten zu vermindertem Einbau anderer Proteine, was z.B. durch den Ausfall von Protein-Protein Wechselwirkungen erklärt werden kann, oder auf einen vermehrten Einbau anderer Tegumentproteine hindeutet. (3) Virale Hüllglykoproteine zeigten die größten quantitativen Schwankungen im Einbau, was die Bewertung des Einbaus der Glykoproteine in die verschiedenen Deletionsmutanten erschwerte. Ausnahme war hier das essentielle Glykoprotein gH, dessen Einbau in die untersuchten Deletionsmutanten im Vergleich zum Wildtyp durchgängig unverändert war.
  • The aim of this study was the qualitative and quantitative mass spectrometric analysis of particles of pseudorabies virus (PrV), the causative agent of Aujeszky’s disease. Proteins from highly purified PrV preparations were resolved by one- (1D) and two-dimensional (2D) electrophoresis and identified by peptide mass fingerprint analysis. By 1D electrophoresis 24 major protein bands derived from purified virions were identified which could be annotated to 25 different viral gene products. Many structural proteins (pUL37, pUL48, pUL18, pUL19 and gB) exhibited multiple isoforms after 2D electrophoresis. By 2D analysis we also identified cellular proteins actin, annexins A1 and A2, HSP70 and HSP27 as constituents of purified PrV virions. For exact quantitative comparison between wild-type and mutant PrV particles we used the SILAC (‘stable isotope labeling by amino acids in cell culture’) technique. This procedure conveniently allows the quantitation of virus and host cell-derived structural components of purified particles. After deletion of the US3, UL47, UL49, or glycoprotein E gene, relative amounts of capsid proteins (e.g. pUL38), capsid-associated proteins (e.g. pUL25), several tegument proteins (e.g. pUL36 and pUL47, if present), and glycoprotein H were unaffected, whereas the content of other tegument proteins (pUL46, pUL48, and pUL49, if present) varied significantly. In the case of the UL48 gene product, a specific increase in incorporation of a smaller isoform was observed after deletion of the UL47 or UL49 gene, whereas a larger isoform remained unaffected. The cellular protein actin was enriched in virions of mutants deficient in any of the tegument proteins pUL47, pUL49, or pUS3. In a further study seven single gene deletion mutants of PrV were analyzed for alterations in the overall composition of the virion beyond the loss of the targeted protein. The UL36 protein was present in equal amounts in wild-type virions an mutants lacking pUL21, pUL49, pUL51, pUS3, or pUS8. Virions lacking pUL11 or pUL16 incorporated less full-length pUL36 than wild-type particles but contained increased amounts of an N-terminal fragment of pUL36 being present only in traces in wild-type virus or the other mutants. Deletion of the tegument protein UL21 resulted in a drastic decrease in the incorporation of the pUL46, pUL49, and pUS3 tegument components into mature virions. Moreover, the attenuated PrV strain Bartha, which among other defects, carries mutations in pUL21, also fails to package pUL46, pUL49, and pUS3 efficiently. By the reconstitution of wild-type pUL21 expression to PrV Bartha and the transfer of mutated PrV Bartha pUL21 into wild-type PrV, we demonstrate that this phenotype ist due to the mutated pUL21.

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Metadaten
Author: Kathrin Michael
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000329-5
Title Additional (English):Qualitative and quantitative mass spectrometric analysis of Pseudorabies virions
Advisor:Prof. Dr. Reinhard Walther
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2007/01/09
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Medizinische Fakultät (bis 2010)
Date of final exam:2006/12/20
Release Date:2007/01/09
Tag:SILAC, Tegumentproteine, quantitative Proteomics
GND Keyword:Herpes, Herpesvirus suis, Proteine, Quantifizierung, Zusammensetzung
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Med. Biochemie u. Molekularbiologie
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit