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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000368-9

Twinribozyme als molekulare Werkzeuge zur RNA Reparatur und Funktionalisierung

  • Verschiedene Strategien sind heute in der Entwicklung, um mit Hilfe von RNA Molekülen die genetische Information auf Transkriptebene zu korrigieren. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob Twinribozyme durch den Austausch kleiner RNA Fragmente das Potential zur RNA Reparatur und ortsspezifischen RNA Funktionalisierung besitzen. Das Hairpinribozym katalysiert je nach Stabilität des Ribozym-Substrat-Komplexes die Spaltung bzw. die Ligation seines Substrats. Twinribozyme wurden durch Verknüpfung von zwei Hairpinribozymeinheiten entwickelt. Die Spaltung eines RNA Substrates an den zwei katalytischen Stellen produziert drei Fragmente: beide äußeren binden fest an das Twinribozym, während die Bindung des mittleren Fragments durch einen Vier-Nukleotid-Loop im Ribozymstrang destabilisiert wird. Dies fördert dessen Dissoziation gegenüber dessen Rückligation. Die Zugabe eines so genannten Reparaturoligonukleotids, das stabil an das Twinribozym anstelle des mittleren Fragments bindet, begünstigt dessen Assoziation zum Ribozym und dessen Ligation zu den übrigen Substratfragmenten. Das Ergebnis ist ein um vier Nukleotide verlängertes Reparaturprodukt. Dies stellt ein Modell für die Reparatur einer Vier-Nukleotid-Deletion auf mRNA Ebene dar. Erstes Ziel dieser Arbeit war es, die bestehende Reaktion kinetisch und thermodynamisch zu charakterisieren. Weiter wurde das Potential von Twinribozymen für die Reparatur anderer RNA Defekte und die ortsspezifische RNA Funktionalisierung untersucht. Schließlich wurde die Twinribozym vermittelte Reparaturreaktion in Zellkulturen getestet. Beim ursprünglichen Vier-Nukleotid-Deletionsmodell wurden unter äquimolaren Konzentrationen aller Fragmente und bei 10 mM Magnesiumchlorid und 37 °C 35 % Reparaturprodukt erhalten. Kinetische Untersuchungen jeder Einzelreaktion konnten zeigen, dass die Tamdemkonfiguration des Twinribozyms die Spalt- und Ligationseigenschaften nicht beeinträchtigt. In thermodynamischen und kinetischen Bindungsuntersuchungen von Modellduplexen, die der Austauschregion ähneln, wurde gezeigt, dass die Struktur des Ribozym-Substrat-Komplexes den Austausch der mittleren Fragmente stark fördert. Eine Voraussetzung zur biophysikalischen und biochemischen Untersuchungen von RNA Molekülen ist ihre ortsspezifische Markierung. Dies wird für bis zu 80 Nukleotide lange RNA Stränge durch chemische Synthese erreicht. Längere modifizierte RNA Moleküle werden mühsam durch Ligation mehrerer Stränge synthetisiert. Eine andere Möglichkeit besteht darin, native RNAs durch in situ Hybridisierung zu markieren. Keine Methode steht somit zur Verfügung, um in vitro Transkripte oder native RNAs intern und kovalent zu modifizieren. Ein synthetisches Substrat konnte ohne Ausbeuteverluste mit verschiedenen Fluoreszenzmolekülen, die chemisch in das Reparaturoligonukleotid eingebaut wurden, mit dem Twinribozym markiert werden. Verschiedene Transkripte wurden ebenfalls erfolgreich mit dem Twinribozym funktionalisiert. Drei verschiedene Modelle wurden untersucht: die Markierung der Transkripte resultierte entweder in einer Verlängerung um vier Nukleotide, in der Einführung von drei Einzelbasenmutationen oder in gar keinem Sequenzunterschied. Um die Ribozymzugänglichkeit der Zielsequenzen zu verbessern wurden erhöhte Temperaturen sowie DNA Oligonukleotide verwendet, die an das Transkript im Bereich der Flanken zur Ribozymbindungssequenz binden. Markierungsausbeuten von jeweils 53, 47 und 11 % wurden erzielt. Die potentielle Anwendung von Twinribozymen für die therapeutische RNA Reparatur erfordert eine effektive Zellaktivität. In vitro Versuche konnten zeigen, dass Twinribozyme unter zellähnlichen Bedingungen aktiv sind. Ein Versuch, die bestehende in vitro Reaktion in menschlichen Zellkulturen durchzuführen und das Reparaturprodukt nach Zelllyse nachzuweisen, scheiterte, da das Ribozym während der Analyse nicht deaktiviert werden konnte. Weiter wurde ein Luciferasereportergen durch die Einführung verschiedener Mutationen so deaktiviert, dass ein neues entwickeltes Twinribozym die Fehler auf mRNA Ebene reparieren sollte. In vitro Versuche mit kurzen synthetischen Substraten zeigten, dass das Ribozym die Fehler effizient prozessiert. Reparaturansätze mit den mutierten Transkripten lieferten aber Reparaturausbeuten unter 1 %, möglicherweise wegen der schlechten Ribozymzugänglichkeit der langen Transkripten. Durch Lumineszenzzellversuche konnte leider keine RNA Reparatur nachgewiesen werden. Twinribozyme erlauben den Austausch kurzer RNA Fragmente innerhalb synthetischer RNAs und Transkripte und akzeptieren dabei modifizierte Sequenzen. Dies öffnet Twinribozymen den Weg als molekulares Werkzeug für die RNA Reparatur und die ortsspezifische RNA Funktionalisierung. Die Erarbeitung von Möglichkeiten, die schlechte Zugänglichkeit der Zielsequenzen zu umgehen, sowie der Erhalt positiver Zellversuche werden über die Verwendung dieses potentialreichen RNA Werkzeugs entscheiden.
  • Several RNA strategies to correct genetic information at transcript level are in development today. This work focuses on the exchange of small RNA fragments with twin ribozymes in order to repair or functionalise RNA. The hairpin ribozyme catalyses both cleavage and ligation of an RNA substrate depending on the stability of the ribozyme-substrate-complex. Twin ribozymes were engineered through rational design by coupling two hairpin ribozyme units to form a tandem ribozyme structure. The cleavage of the RNA substrate in both catalytic units produces three different RNA fragments: the two fragments located on the outer sides stay tightly bound to the twin ribozyme whereas the binding of the one in the middle is destabilised by a four-nucleotide loop in the ribozyme strand. This loop promotes the dissociation of the middle substrate fragment and hinders its back ligation. The subsequent addition of a repair oligonucleotide that strongly binds to this part of the twin ribozyme favours its association and ligation to the outer fragments and results in a four-nucleotide longer repair product. The whole reaction therefore mimics the repair of a four-nucleotide deletion at RNA level. The first major part of this work was to kinetically and thermodynamically characterise the repair reaction. Secondly the potential of twin ribozymes for the repair of other small RNA defects as well as for the site specific RNA functionalisation was studied; finally the twin ribozyme catalysis was investigated in cell cultures. For the four-nucleotide deletion model 35 % repair product were obtained under equimolar strand concentrations and 10 mM magnesium chloride at 37 °C. Cleavage and ligation kinetic studies could show that the tandem configuration of the twin ribozyme does not change the reactivity compared to the single unit hairpin ribozymes. Thermodynamic and kinetic binding studies with small duplexes that mimic the exchange region clearly indicated that the structure of the ribozyme-substrate-complex favours the exchange of the middle fragments. A requirement for biophysical and biochemical RNA studies is site-specific RNA labeling. Whereas modified oligonucleotides up to 80 nucleotides in length are easily synthesised using automated solid phase synthesis, longer RNA molecules must be obtained through enzymatic ligation of several smaller strands. Another possibility to label native RNAs is in situ hybridisation. So far no method is available to covalently and site-specifically label in vitro transcripts or native RNAs. With our twin ribozyme system we were able to label synthetic RNA substrates with different fluorescent dyes and biotin. Therefore the repair oligonucleotide was internally labeled during solid phase synthesis. Several transcripts were also successfully labeled with twin ribozymes. Transcript labeling resulted either in elongation of the transcript by four nucleotides, in introduction of three point mutations or in an unchanged sequence. Maximal labeling yields of 53 %, 47 % and 11 % were achieved at elevated temperatures and with the help of DNA antisense oligonucleotides to relax the transcript secondary structure and thus allowing better ribozyme binding. The potential use of twin ribozymes for therapeutic RNA repair requires an effective cell activity. We could show that twin ribozymes are active in vitro under cell like conditions. To study the cell repair activity, the repair reaction was carried out in human cell cultures and the repair product was detected through hybridisation after cell lysis. Unfortunately cell activity could not be demonstrated, because the ribozyme could not be deactivated during the subsequent analysis. A cell reporter system was therefore developed based on the deactivation of a luciferase reporter gene by introducing several mutations in the gene. Repair at RNA level with a newly engineered twin ribozyme should restore luciferase activity. In vitro assays with short synthetic substrates confirmed that the new ribozyme efficiently processes all mutations but in vitro repair of the mutated transcripts only provided yields less than 1 %, probably because of the bad ribozyme availability. Furthermore no positive cell luminescence assays could be obtained. Twin ribozymes allow the exchange of short RNA fragments within synthetic RNAs and transcripts and accept modified sequences. This may clear the way for twin ribozymes as molecular tools for RNA repair and site-specific RNA labeling. Solutions to overcome bad ribozyme availability of long transcripts as well as positive cell assays will decide on the practical use of this powerful RNA tool.

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Metadaten
Author: Stéphanie Vauléon
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000368-9
Title Additional (English):Twinribozymes as molecular tools for RNA repair and functionalisation
Advisor:Prof. Dr. Sabine Müller
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2007/05/23
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2007/04/11
Release Date:2007/05/23
Tag:Hairpinribozym, Ligation, Renilla Luciferase
GND Keyword:Enzymkinetik, Fluoreszenzmarkierung, Funktionalisierung <Chemie>, RNS, RNS-Edierung, RNS-Reparatur, RNS-Synthese, Ribozym, Small RNA
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie