• search hit 1 of 1
Back to Result List

Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000406-8

Modulation von Ribozymaktivität durch gezielte Kontrolle der Sekundärstruktur

  • Ribozyme sind katalytisch aktive RNA-Strukturen, die unter anderem in viralen Satelliten-RNAs entdeckt wurden, wo sie durch reversible Spaltung des Phosphatrückgrates die virale Replikation unterstützen. Durch gezielte strukturelle Manipulation von Ribozymen entstehen wertvolle Werkzeuge, die in vielen bioanalytischen, biotechnologischen und gentherapeutischen Bereichen Anwendung finden. Diese Arbeit beschäftigt sich mit dem funktionalen Design von verschiedenen Ribozymmotiven, deren kinetische und strukturelle Charakterisierung sowie deren potentielle Anwendung. In einem ersten Projekt sollten durch rationales Design RNA-Schalter, sogenannte Riboswitches, entwickelt werden. Die Aktivität dieser schaltbaren Ribozyme hängt von einem externen Kofaktor ab. Solche Konstrukte können durch gezielte Kombination einer natürlichen Ribozymdomäne mit einer Aptamerdomäne, die spezifisch einen Kofaktor (darunter Nukleinsäuren, Peptide, organische Moleküle und Metallionen) binden kann, gewonnen werden. Durch Bindung dieses Kofaktors wird eine konformelle Änderung innerhalb der Ribozymstruktur erzwungen die einen Anstieg- oder Abfall der katalytischen Aktivität zur Folge hat. Derartige Systeme besitzen biosensorisches Potential. Betrachtet man den Kofaktor als Analyten, kann das Bindungsereignis, also die Detektion, über ein Spaltereignis beobachtet werden. Die Reversibilität solcher Detektionssysteme konnte bisher nicht demonstriert werden, würde aber deren Attraktivität und Anwendungspotential erhöhen. In dieser Arbeit wurden Ribozyme auf Basis des Hairpin-Motivs entwickelt, die in Abhängigkeit von Flavinmononukleotid (FMN) aktiv sind. Um die Reversibilität des Prozesses zu gestatten, müsste FMN beliebig aus der Aptamerdomäne entfernt und in diese wieder eingelagert werden können. Dies sollte über die Kontrolle der Molekülgeometrie des Kofaktors erfolgen. Durch chemische Reduktion von FMN werden strukturelle und elektronische Veränderungen innerhalb des Moleküls hervorgerufen, die die Bindungsaffinität verringern sollten. Versuche mit Reduktionsmitteln konnten die Reversibilität des Schaltvorganges in einem ersten Ansatz demonstrieren. Um ein mehrmaliges, kontrolliertes Schalten zu gestatten, wurde zur gezielten Manipulation des Oxidationszustandes von FMN eine elektrochemische Zelle entwickelt. Dazu musste das klassische Drei-Elektroden-System dem hier vorliegenden System angepasst werden. Zum einen muss die quantitative Reduktion/Oxidation von FMN in einem kleinen Probenvolumen von einigen Mikrolitern gewährleistet werden, zum anderen sollte unter Sauerstoffausschluss gearbeitet werden, um unerwünschte Reoxidationsprozesse zu verhindern. Mit der entwickelten Zelle konnte in einem Spaltexperiment ansatzweise die Verringerung der Ribozymaktivität durch elektrochemische Reduktion des Kofaktors demonstriert werden. Schnelles und präzises Schalten des Systems wurde durch Diffusionsprozesse der reagierenden Spezies zur Elektrodenoberfläche limitiert und konnte mit dieser Anordnung nicht demonstriert werden. Neben kinetischen Studien sollten strukturelle Untersuchungen die Charakterisierung des RNA-Schalters vervollständigen. Hierbei wurden die konformellen Änderungen innerhalb des Ribozyms bei Bindung des Kofaktors ESR-spektroskopisch studiert. Allgemein müssen dazu Nukleinsäuren mit paramagnetischen Spinsonden markiert werden. In diesem Zusammenhang wurden Synthese- und Markierungsmethoden zum Erhalt spinmarkierter Oligonukleotide etabliert. Ein zweites Projekt beschäftigte sich mit der Entwicklung von Reparatursystemen auf Basis kleiner katalytischer RNA-Motive. Die in diesem Zusammenhang entwickelten Twinribozyme besitzen großes Potential zur Reparatur von Gendefekten auf RNA-Ebene. Hierbei wird ein kurzer Sequenzabschnitt innerhalb eines RNA-Stranges gegen eine alternative Sequenz durch doppelte Spaltung und Ligation ausgetauscht. Diese Methode sollte es ermöglichen, mutierte Sequenzbereiche auf mRNA-Ebene gegen die entsprechend korrekte Sequenz zu ersetzen und Gendefekte zu beheben. Twinribozyme entstehen durch Duplikation zweier katalytischer Motive und wurden als erstes unter Verwendung des Hairpinribozymmotivs entwickelt. Da nicht alle Substratsequenzen vom Hairpinribozym toleriert werden, wurde im Rahmen dieser Arbeit die Eignung eines Hammerheadribozyms zur Entwicklung eines Twinribozyms überprüft, um die Palette derartiger Werkzeuge zu erweitern. Gezeigt werden konnte, dass der Austausch einer Sequenz zwar katalysiert wird, die geringe Produktausbeute von nur 3% eine gentherapeutische Anwendung zunächst noch in Frage stellt. Hier sollten strukturelle Optimierungen des Systems zu einem besseren Ergebnis führen. Insgesamt konnte demonstriert werden, dass die Aktivität von RNA-Enzymen gezielt durch die Einführung von charakteristischen Strukturelementen manipuliert und kontrolliert werden kann und somit Systeme mit hohem Anwendungspotential geschaffen wurden.
  • Discovered in viral satellite RNAs, Ribozymes are catalytically active RNA structures that mediate viral replication by reversible cleavage of their phosphate backbone. During the past decade, new tools have been generated by structural manipulation of ribozymes that have proven potential to be applied in bioanalytics, biotechnology and gene therapeutics. This thesis describes functional design of ribozymes, their kinetic and structural investigation as well as evaluation of their application potential. One project deals with the development of switchable ribozymes by rational design. The activity of allosteric ribozymes that also called riboswitches depends on external cofactors. Such controllable catalysts are formed by attaching the ribozyme domain to an aptamer that binds a cofactor (among nucleic acids, peptides, small organic compounds and metal ions) specifically and with high affinity. The binding event induces conformational changes of the catalytic part that result in up or down regulation of cleavage activity. Due to modulation of the ribozyme activity upon cofactor binding, these systems are expected to be promising biosensors: binding of cofactors or analytes becomes detectable via a cleavage event. However, most artificially designed riboswitches do not work in a reversible manner and the catalytic activity is either up or down regulated upon addition of the allosteric cofactor. In this work allosteric hairpin ribozymes were designed that are active in the presence of Flavinemononucleotide (FMN), whereas the absence of FMN induces loss of activity. To switch in a reversible mode FMN has to dissociate and bind to aptamer domain in an alternating pattern. This should be achieved by controlling the molecular geometry of cofactor. Reduction of FMN induces structural and electronic changes of molecular features that in turn were expected to decrease binding affinity. Cleavage experiments that were carried out in the presence of reducing agents demonstrate impressively the reversibility of the switching process. For precise control of the oxidation state that in turn provides repetitive switching an electrochemical cell has to be conceived, taking into account a number of prerequisites. A fundamental demand was to reduce/oxidise FMN in a small reaction volume of some micro litre quantitative to induce significant change in cleavage activity. In addition complete exclusion of oxygen had to be assured to avoid undesired reoxidation. Cleavage reactions carried out in the cell demonstrate loss of ribozyme activity by means of electrochemical reduction of cofactor. Fast and precise switching could not be demonstrated so far because of diffusion that limits FMN movement to the electrode surface and slows down the reduction/oxidation process. Besides kinetic studies, structural investigations of ribozyme folding had to complete characterisation of riboswitch. Structural rearrangements upon binding of cofactor were studied using EPR spectroscopy. In general, for this kind of investigation biomolecules have to be tagged with paramagnetic spinlabels. In this context synthesis and label procedures of spinlabeled oligonucleotides were established. A second project deals with the development of repair systems based on small catalytic ribozyme motifs. Recently, twin ribozymes have been developed that offer high potential for repairing gene defects on mRNA level. To this aim, a short sequence within the substrate RNA is exchanged against an alternative sequence by catalysing two cleavage and two ligation events. Mediating this exchange reaction, twin ribozymes are promising tools to substitute defect sequences that cause a variety of genetic diseases. Twin ribozymes are generally designed by tandem duplication of two catalytic units and were first generated by using the hairpin ribozyme motif. Due to the consensus sequence of the hairpin ribozyme not all substrate sequences are tolerated. In this work, the potential of the hammerhead ribozyme for investigation of twin ribozymes was assessed to enlarge the variety of tools for genetic repair. It was shown, that hammerhead twin ribozymes mediate the exchange reaction basically, but low yields of obtained repair product probably confine the potential of application. Structural alteration and optimization of reaction conditions may lead to effective repair. In summary, it has been shown that ribozyme activity can be manipulated and controlled specifically by introduction of secondary structure elements that in turn generate attractive tools for a variety of applications.

Download full text files

Export metadata

Additional Services

Share in Twitter Search Google Scholar
Metadaten
Author: Denise Kathrin Strohbach
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000406-8
Title Additional (English):Modulation of ribozyme activity by site-directed alteration of ribozyme structure
Advisor:Prof. Dr. Sabine Müller
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2007/09/12
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2007/06/12
Release Date:2007/09/12
Tag:Flavinmononukleotid, Riboswitch, Spinmarkierung, Twinribozym, rationales Design
Flavinemononucleotide, rational design, riboswitch, spinlabel, twin ribozyme
GND Keyword:Biosensor, Fluoreszenzmarkierung, Gentherapie, RNS-Reparatur, RNS-Synthese, Ribozym
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie