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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000359-8

Veränderungen des Aktin-Zytoskeletts in CD2AP-defizienten Podozyten

  • Die Podozyten bilden mit ihren Aktin-reichen, interdigitierenden Fußfortsätzen und mit Schlitzmembran die entscheidende Einheit der glomerulären Filtrationsbarriere. Verschiedene Störungen der Podozytenfunktion bewirken chronische Nierenerkrankungen, darunter die fokal segmentale Glomerulosklerose. Mäuse, die keine Expression des 80 kDa-Proteins CD2AP in den Podozyten aufweisen, entwickeln auf noch ungeklärte Weise eine progrediente und in nur sechs Wochen post partum letal endende Niereninsuffizienz mit Proteinurie. Histopathomorphologisch lässt sich ein Verlust der Podozyten-Fußfortsätze sowie eine Glomerulosklerose nachweisen. Auch beim Menschen sind Mutationen von CD2AP mit einer Glomerulosklerose assoziiert. CD2AP ist ein Docking-Protein der CMS/CIN85-Familie. Mit seinen drei SH3-Domänen, seiner Prolin-reichen Region und weiteren Bindungsstellen ist CD2AP in der Lage, mit einer Vielzahl von Proteinen zu interagieren. Eine Gruppe der Interaktionspartner von CD2AP bilden F-Aktin und Aktin-assoziierte Proteine. Da wir in vorangehenden Arbeiten zeigen konnten, dass CD2AP in kultivierten Podozyten an hochdynamischen F-Aktin-Spots lokalisiert ist (Welsch et al. 2001; Welsch et al. 2005), war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, zu klären, ob CD2AP an der Regulation der Aktin-Dynamik in den Podozyten beteiligt ist. Zu diesem Zweck wurde das Aktin-Zytoskelett von kultivierten Podozyten aus CD2AP-Knockout-Mäusen im Vergleich zu kultivierten Wildtyp-Podozyten untersucht. Es zeigte sich, dass CD2AP-/--Podozyten deutliche phenotypische Veränderungen im F-Aktin-Zytoskelett gegenüber Wildtyp-Podozyten aufweisen. So besitzen CD2AP-/--Podozyten eine polygonale Zellmorphologie aufgrund fast fehlender Lamellipodia sowie vermehrt F-Aktin-Spots, F-Aktin-Stress-Fasern und damit auch größere Fokaladhäsionen. Neben den zunächst beobachteten strukturellen Veränderungen des Aktin-Zytoskeletts fanden sich auch deutliche Veränderungen in der Aktin-Dynamik. So erfolgt der Abbau des Aktin-Zytoskeletts in CD2AP-/--Podozyten nach der Inhibierung der Plus-Enden der Aktin-Filamente mit Cytochalasin D verlangsamt und inkomplett. Ein morphologisch nicht unterscheidbarer inkompletter Abbau des Aktin-Zytoskeletts konnte durch Inhibierung der Aktomyosin-ATPase-Aktivität mittels Blebbistatin in den Wildtyp-Zellen erzeugt werden, was auf eine mögliche Interaktion zwischen CD2AP und Myosin II hinweist. Unter Verwendung der FRAP-Technik konnte in GFP-Aktin-transfizierten CD2AP-/-- und Wildtyp-Podozyten der Umsatz von Aktin bestimmt werden. Hierbei zeigte sich, dass CD2AP-/-- und Wildtyp-Podozyten keine unterschiedlichen Aktin-Umsatzgeschwindigkeiten besitzen. Durch Stimulation mit Epidermal Growth Factor können in den Podozyten ringförmige hochdynamische Aktin-Strukturen, sogenannte RiLiS (Ring-Like Structures), hervorgerufen werden. In CD2AP-/--Podozyten war die Bildung und die Motilität von RiLiS erheblich vermindert. Durch Transfektion der CD2AP-/--Podozyten mit GFP-CD2AP konnte die Bildung und Motilität der RiLiS wiederhergestellt werden. Die Hemmung der Aktomyosin-ATPase mit Blebbistatin sowie die Hemmung der PI3-Kinase mit Wortmannin oder LY294002 blockierten die Bildung von RiLiS, wobei nur die Hemmung der PI3-Kinase mit einer Motilitätsverminderung einherging. Messungen der Phosphorylierung von AKT und ERK nach Stimulation mit EGF zeigten jedoch eine unverminderte Aktivierung der beiden Signalwege in CD2AP-/--Podozyten. Auch eine verminderte Bildung von PIP3 in den RiLiS konnte durch Fluoreszenzintensitätsmessungen mit PIP3-bindenden GFP-PH-Fusionsproteinen ausgeschlossen werden. Die C-terminale Hälfte von CD2AP enthält eine putative F-Aktin-Bindungsstelle und Bindungsstellen für Aktin-assoziierte Proteine. Die Expression eines GFP-Fusionsproteins der C-terminalen Hälfte von CD2AP (GFP-?N-CD2AP, AS 325-637) war ausreichend, um eine Lokalisation des Konstrukts in den RiLiS zu erreichen, während ein GFP-Fusionsprotein der N-terminalen Hälfte von CD2AP keine Anreicherung in den RiLiS zeigte. GFP-DN-CD2AP war ebenfalls in der Lage die Bildung und Motilität von RiLiS in den CD2AP-/--Podozyten wiederherzustellen. Die schrittweise Verkürzung des GFP-DN-CD2AP-Konstrukts am C-terminalen-Ende zeigte, dass die Prolin-reiche Region von CD2AP (AS 325-424) zusammen mit dem Bereich zwischen den Aminosäuren 424-505 für die Bildung und Motilität der RiLiS essenziell ist. Das Konstrukt, das nur noch die Prolin-reiche Region von CD2AP enthielt, verminderte die Bildung und Motilität der RiLiS im Sinne eines dominant-negativen Effektes. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit erstmals, dass CD2AP in den Podozyten bei der Regulation der Aktin-Dynamik eine nicht-redundante Funktion besitzt. Der Bereich von CD2AP, der die Bindungsstellen für F-Aktin und Aktin-assoziierte Proteine enthält, spielt für die Ausübung dieser Funktion eine entscheidende Rolle
  • CD2AP (CD2-associated protein) knock-out mice die of renal failure at the age of 6-7 weeks. The renal phenotype can be rescued by podocyte-specific expression of CD2AP, confirming the critical function of CD2AP in podocytes. Since CD2AP localizes to specific F-actin structures in podocytes and since CD2AP interacts with F-actin, cortactin, and capping protein, CD2AP may play an important role in the regulation of the actin cytoskeleton in podocytes. We therefore examined the actin cytoskeleton in conditionally immortalized podocytes derived from CD2AP knock-out mice and in wild-type (WT) podocyte cell lines. CD2AP deficient (CD2AP-/-) podocytes predominantly possess a polygonal shape with more stress fibers, larger focal adhesions and less lamellipodia as compared to WT podocytes. Upon treatment with cytochalasin, CD2AP-/- podocytes show an incomplete disruption of the actin cytoskeleton. In response to stimulation with epidermal growth factor (EGF), the formation and motility of ring-like actin structures (RiLiS) are markedly reduced in CD2AP-/- podocytes. The morphology of RiLiS is altered in CD2AP-/- podocytes as well. The phenotype of the actin cytoskeleton and of actin dynamics is rescued by transfection of CD2AP-/- podocytes with a GFP-CD2AP construct. In contrast to the N-terminal half of CD2AP, the C-terminal half of CD2AP, containing cortactin, capping protein and F-actin binding sites, was sufficient to confer localization into RiLiS, and to rescue RiLiS formation in CD2AP-/- podocytes. Our data demonstrate that CD2AP plays a non-redundant role in actin dynamics in podocytes, possibly representing a critical function of CD2AP in podocytes in vivo.

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Metadaten
Author: Elena Doroshenko
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000359-8
Title Additional (English):Alteration of the actin cytoskeleton in CD2AP-deficient podocytes
Advisor:Prof. Dr. Karlhans Endlich
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2007/05/07
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Medizinische Fakultät (bis 2010)
Date of final exam:2007/03/13
Release Date:2007/05/07
Tag:Aktin-Zytoskeletts, CD2AP, Podozyt
CD2AP, actin cytoskelton, podocyte
GND Keyword:Actin-Filament
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Anatomie und Zellbiologie
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit