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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000432-3

Aufbau eines Assays zur in vitro-Selektion einer Adenosindesaminase aus einer RNA-Bibliothek

  • Diese Arbeit beschreibt den Aufbau eines Assays zur Selektion eines Ribozyms, welches die Desaminierung von Adenosin zu Inosin katalysiert. Diese Reaktion spielt im Organismus, wo sie proteinkatalysiert abläuft, eine wichtige Rolle (Nukleotidmetabolismus, RNA-Editing). Zusätzlich besitzt ein solches Ribozym das Potenzial zur gezielten Veränderung von RNA-Sequenzen. Das Projekt hat somit evolutionstheoretische (RNA-Welt-Hypothese) als auch gentherapeutische Relevanz. Zentraler Punkt des vorgestellten Assays ist die Markierung einer Mischung verschiedener RNA-Sequenzen (= Bibliothek) mit dem Substrat Adenosin. Dieses trägt an der exozyklischen Aminogruppe eine Biotinfunktion. Wird diese Bibliothek auf einer festen Phase über die Biotin/Streptavidin-Wechselwirkung immobilisiert und den Selektionsbedingungen unterworfen, werden Spezies mit der gewünschten Aktivität in Lösung entlassen. Diese können eluiert und über RT-PCR angereichert werden. Die Funktionalisierung der RNA-Bibliothek geschieht am 5’-Ende jeder Sequenz durch Transkriptionspriming aus einer chemisch synthetisierten DNA-Bibliothek in Gegenwart der vier NTPs und eines Guanosin-5’-monophosphatderivats, dem „Initiator“. Letzteres ist über die 5’-Phosphatfunktion mit dem biotinylierten Substrat Adenosin verknüpft. Das Initiatormolekül wurde in zwei Strategien synthetisiert. Die erste Strategie fand an der festen Phase unter Verwendung des Phosphoramiditverfahrens statt und lieferte Initiator in nanomolarem Maßstab. Die zweite Strategie bestand aus einer 17-stufigen Synthese in Lösung und ergab fast identisches Initiatormolekül in µmolarem Maßstab. Beide Initiatormoleküle wurden erfolgreich zur Funktionalisierung einer RNA eingesetzt. Zur qualitativen Dokumentation des Einbaus des Initiators wurde eine auf Chemilumineszenzdetektion basierende Methode entwickelt. Dabei wurden die Transkriptionsprodukte auf eine Nylonmembran immobilisiert und mit einem Fusionsprotein aus Alkalischer Phosphatase und Streptavidin inkubiert, welches spezifisch den Biotinrest bindet. Durch Zugabe eines möglichen Substrats der Alkalischen Phosphatase wird ein Chemilumineszenzsignal erzeugt, was über einen Röntgenfilm dokumentiert wurde. Dieser qualitative Nachweis wurde erweitert, um die Einbaueffizienz zu quantifizieren. Dazu wurde eine RNA, welche zu 100% mit dem Initiatormolekül markiert war, mit Hilfe des Phosphoramiditverfahrens hergestellt. Diese als Standard fungierende RNA wurde in definierter Menge zusammen mit definierten Mengen an statistisch funktionalisierten Primingprodukt geblottet. Die Quantifizierung der Chemilumineszenz der Proben erfolgte mit Hilfe eines Photosystems und durch Integration der Signalintensitäten. Dadurch konnte der Anteil der in den durchgeführten Primingreaktionen mit Initiator markierten RNA zu maximal 3 % bestimmt werden. Obwohl eine Erhöhung dieses Wertes z.B. durch Optimierung der Initiatorstruktur wünschenswert ist, ist damit die Funktionalisierung einer RNA-Bibliothek in einer für die Selektion ausreichenden Menge durchaus möglich. Zur Evaluation des Assays wurde der Selektionsschritt simuliert, in welchem ein über das Initiatormolekül festphasengebundenes Ribozym spezifisch zur Selbstspaltung aktiviert wird. Zu diesem Zweck wurden ein Hammerheadriboyzm, ein Hairpinribozym sowie ein DNAzym untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass die Spaltaktivität aller drei Systeme durch Funktionalisierung mit dem Initiator in Lösung fast vollständig inhibiert wird, unmarkierte Spezies unter identischen Bedingungen jedoch uneingeschränkte Spaltaktivität zeigen. Die beobachtete Inhibierung beruht auf einem intramolekularen Effekt, der möglicherweise zu einer Verschiebung des Konformerengleichgewichts der Testsysteme hin zu spaltinaktiven Konformeren führt. Zusätzlich wurde die Spaltaktivität des mit Initiator markierten und an einer Festphase immobilisierten Hairpinribozyms untersucht. Auch hier war eine stark verringerte Spaltaktivität zu beobachten, welche jedoch in unspezifischen Wechselwirkungen zwischen Festphase und Ribozym begründet liegen könnten. Die verwendeten Systeme eignen sich offenbar nicht zur Evaluierung des Assays, was jedoch die Möglichkeit offen lässt, dass im geplanten Assay selektierte RNA-Sequenzen die Funktionalisierung mit Initiator tolerieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit erlauben den Schluss, dass die gewählte Strategie zur Selektion der Adenosindesaminase einige Punkte beinhaltet, welche nach Möglichkeit optimiert werden müssen, um eine effizientere Selektion durchführen zu können. Prinzipiell ist die Vorraussetzung für die Selektion der Adenosindesaminase durch die beschriebene Methode jedoch geschaffen und kann basierend auf den vorgestellten Ergebnissen in zukünftigen Studien durchgeführt werden.
  • This work describes the design of an assay for the selection of a ribozyme that catalyzes the deamination of adenosine to inosine. This reaction is involved in different biochemical pathways in the organism, where it is catalyzed by proteins (nucleotide metabolism, editing). Furthermore, a ribozyme with these characteristics can be potentially used to specifically alter RNA sequences. Hence, this project has relevance regarding evolutionary theory (RNA-world hypothesis) as well as gene therapy. A central feature of the assay presented here is the specific functionalization of a mixture of different RNA molecules (= library) with the substrate adenosine that carries a biotin moiety connected to its exocyclic amino group. This library can be immobilized on a solid phase by means of biotin/streptavidin-interactions. When subjected to the selection conditions, species with the desired activity are cleaved off. These liberated sequences can be enriched by RT-PCR. Functionalization at the 5’-end of each sequence is accomplished by transcription priming. In this procedure, a chemically synthesized DNA library is transcribed in presence of the four NTPs and a guanosine 5’-monophosphate derivative (so-called initiator molecule). This molecule is decorated with the biotinylated adenosine substrate via the 5’-phosphate moiety. The initiator was synthesized by two different strategies: The first route took place on the solid phase using phosphoamidite chemistry and resulted in initiator molecule in nanomolar yield. In order to obtain initiator molecule in higher yield, a second strategy was carried out that consisted of 17 steps in solution. This second initiator molecule differed slightly in its structure. Both initiator molecules were successfully used to label RNA by transcription priming. In order to verify the incorporation of the initiator molecule, a chemiluminescence-based method was developed. In this strategy, transcription priming product was immobilized on a nylon membrane and treated with a protein conjugate consisting of an alkaline phosphatase and a streptavidin moiety, the latter of which specifically binds to the biotin part of the label. Upon addition of a substrate of the phosphatase moiety, a chemiluminescence signal is generated that can be detected with a film. Additionally, this procedure was extended to quantify the incorporation rate. To this aim, a RNA that was used as a standard was completely labelled with the initiator molecule by solid phase chemistry. Defined amounts of this standard RNA together with defined amounts of the statistically labelled transcription priming product were blotted. By using a photo system that integrates the chemiluminescence intensities resulting from each of the samples, the incorporation efficiency in the priming experiments could be determined to be not more than 3%. Clearly this incorporation efficiency has to be optimized in further studies. However, with this value a sufficient amount of functionalized RNA molecules for a selection procedure can be obtained. In order to further evaluate the assay, three catalytic oligonucleotide structures (a hammerhead ribozyme, a hairpin ribozyme and a DNAzyme) were tagged with the initiator molecule. It was observed that all three systems almost completely loose cleavage activity in solution upon 5’-functionalization with the initiator molecule. In contrast, untagged species retain full activity. The inactivation is due to an intramolecular effect that possibly causes the systems to shift towards inactive conformers, resulting in a deterioration of cleavage activity. Additionally, the hairpin ribozyme was tested for cleavage activity upon immobilization on the solid phase by means of the initiator molecule tag. Again, a significant inactivation was observed that could be due to unspecific interactions between the solid phase and the hairpin ribozyme structure. Apparently, the catalytic oligonucleotides used as test systems are not useful as model systems. This leaves open the possibility that catalytic structures can be successfully selected with the assay, since selected ribozymes inevitably will have to tolerate the key features (functionalization by initiator and immobilization). In summary, the results suggest that the presented strategy in order to be efficient deserves further improvement, e.g. optimization of the incorporation rate. Nevertheless, the described results present the basis for a successful selection of an adenosine deaminase that can be carried out in future studies.

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Metadaten
Author: Jörn Wolf
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000432-3
Title Additional (English):Design of an Assay for the in vitro-Selection of an Adenosine Deaminase from an RNA Library
Advisor:Prof. Dr. Sabine Müller
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2007/12/11
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2007/12/05
Release Date:2007/12/11
Tag:Adenosindesaminierung, SELEX, Transkriptionspriming
SELEX, adenosine deamination, transcription priming
GND Keyword:Künstliche Evolution, Ribozym
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie