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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000759-5

Abbau von Phenylalkanen und weiteren alkylsubstituierten Aromaten durch Hefen und filamentöse Pilze

  • Gegenstand der vorliegenden Arbeit war es, den Abbau von Phenylalkanen durch eukaryotische Mikroorganismen, insbesondere Pilze, zu untersuchen. Im Focus der Dissertation lagen dabei Untersuchungen mit der Hefe Trichosporon asahii SBUG-Y 833. Des Weiteren erfolgten Analysen mit Candida maltosa SBUG Y 700, Trichosporon mucoides SBUG Y 801 und neun filamentösen Pilzen der Gattungen Cunninghamella, Fusarium, Lecanicillium, Mucor, Penicillium, Sporothrix und Umbelopsis. Als Substrate wurden Phenylalkane mit fünf bis zehn und zwölf Kohlenstoff-Atomen in der Alkylseitenkette eingesetzt. Zur Charakterisierung der Abbau- und Transformationsleistungen der Hefen, insbesondere von T. asahii, erfolgten darüber hinaus Biotransformationsexperimente mit Phenylalkan-Derivaten und aromatischen Säuren. Candida maltosa 1. Mit der Hefe C. maltosa, die zur Assimilation von n Alkanen befähigt ist, konnte ein Wachstum mit Phenylalkanen (0,5 % [v/v]), deren Alkylseitenkette mindestens 8 Kohlenstoff-Atome aufwiesen, ermittelt werden. 2. In Biotransformationsexperimenten mit ungeradzahligen Phenylalkanen (Phenylheptan und Phenylnonan) konnte eine kontinuierliche extrazelluläre Akkumulation von Benzoesäure nachgewiesen werden. Phenylalkane mit einer geraden Anzahl von Kohlenstoff-Atomen in der Alkylseitenkette (Phenylhexan, Phenyloctan, Phenyldecan und Phenyldodecan) werden via Phenylbuttersäure und 4 Phenyl 3-butensäure zu Phenylessigsäure abgebaut, die ebenso wie Benzoesäure extrazellulär angereichert wird. 3. C. maltosa ist nicht zur weiteren Oxidation von Benzoesäure und Phenylessigsäure befähigt und akkumuliert daher diese Säuren während des Phenylalkan-Abbaus als dead-end-Produkte. Trichosporon asahii 1. In Wachstumsexperimenten mit T. asahii konnte gezeigt werden, dass die Hefe n Alkane (n Dodecan, n Tetradecan, n Hexadecan) und Phenylalkane mit mindestens sieben Kohlenstoff-Atomen in der Alkylseitenkette assimilieren kann. 2. In Biotransformationsexperimenten mit ruhenden Zellen und Phenylheptan konnten anhand von HPLC-, GC-MS- und z. T. NMR-Analysen neun Produkte identifiziert werden: 7 Phenylheptansäure, 7-(2 Hydroxyphenyl)-heptansäure, 3 (2 Hydroxyphenyl) propionsäure, Benzoesäure, 3,4 Dihydroxybenzoesäure, Cumarin, 4 Hydroxycumarin, 4,6 Dihydroxycumarin und 4,8 Dihydroxy-cumarin. 3. Die Bildung der Metaboliten 2 Hydroxyphenylheptansäure und 2 Hydroxyphenylpropionsäure sowie der Cumarine konnte erstmals durch die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit für den mikrobiellen Abbau von Phenylalkanen beschrieben werden. Die hydroxylierten Cumarine 4 Hydroxy-, 4,6 Dihydroxy- und 4,8 Dihydroxycumarin wurden bis Versuchende kontinuierlich im Inkubationsmedium akkumuliert, während die übrigen sechs Produkte nur zwischenzeitlich durch die Hefe ausgeschieden wurden. Die Inkubation von T. asahii mit Phenyloctan führte dagegen nur zum Nachweis der hydroxylierten Cumarine. In Biotransformationsexperimenten mit Phenylnonan, Phenyldecan und Phenyldodecan konnte als einziger Metabolit 4 Hydroxy-cumarin detektiert werden. Die für andere Hefen typischen Abbauprodukte wie Benzoesäure und Phenylessigsäure wurden durch diese Aromaten verwertende Hefe nicht akkumuliert. 4. Die Bildung von 4 Hydroxycumarin konnte auch in Biotransformationsexperimenten mit Phenylheptansäure, 2 Hydroxyphenyl-propionsäure, trans 2 Hydroxyzimtsäure sowie Cumarin nachgewiesen werden. Während die Transformation der zwei ortho-hydroxylierten Säuren in Ausbeuten von über 70 % 4 Hydroxycumarin innerhalb von 24 h resultierte, wurden nur 9,4 % der Phenylheptansäure und ca. 13 % des Cumarins in 4 Hydroxycumarin transformiert. 6. Im Hinblick auf die medizinische Bedeutung der Cumarine wurde die Bildung von Cumarinen aus den Präkursor-Stoffen 2,4 Dihydroxyphenylpropionsäure und 7 Hydroxycumarin durch T. asahii geprüft. Dabei konnte 4,7 Dihydroxycumarin während der Inkubation mit 2,4 Dihydroxyphenyl-propionsäure und 7 Hydroxycumarin nachgewiesen werden und zusätzlich 6,7 Dihydroxycumarin mit 7 Hydroxycumarin als Substrat. Eine 20-fache Steigerung der 6,7 Dihydroxycumarin-Konzentration wurde mit Zellen einer Phenol-Kultur im Vergleich zu Zellen, die mit Hefeextrakt kultiviert wurden, erreicht, was auf die Beteiligung einer induzierbaren Phenolhydroxylase hindeutet. 7. Unter Verwendung des Cytochrom P450-Inhibitors 1 Aminobenzotriazol konnte eine Beteiligung von Cytochrom-P450-Enzymen an der ortho-Hydroxylierung des Benzenrings von Phenylalkanen bzw. alkylsubstituierten aromatischen Säuren ermittelt werden. Diese Reaktion ist neben der Einführung einer Doppel-bindung in der Alkylseitenkette eine wesentliche Voraussetzung für die Bildung von Cumarinen. 8. Während der Inkubation von T. asahii mit dem Phenylheptan-Derivat Heptanophenon wurden primär Metaboliten detektiert, die am C1-Atom der Alkylseitenkette eine Hydroxy-Gruppe aufweisen und/oder subterminal am C4-, C5- und C6-Atom oxidiert sind. Aufgrund der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit konnte für Hefen erstmals eine subterminale Oxidation von gesättigten Alkylketten nachgewiesen werden. Trichosporon mucoides 1. In den Untersuchungen mit T. mucoides konnte gezeigt werden, dass die Hefe nicht zur Assimilation von n Alkanen (n Dodecan, n Tetradecan, n Hexadecan) befähigt ist. Die Kultivierung mit Phenylnonan und Phenyldecan führte zwar nur zu einer geringen, dennoch signifikanten Zunahme der Biomasse. 2. Obwohl T. mucoides keine n Alkane verwerten kann, wurden in Biotransformationsexperimenten mit Phenylalkanen Metaboliten detektiert, die nicht nur aus terminalen und ß Oxidationsreaktionen an der Alkylseitenkette hervorgegangen sind, sondern auch subterminalen und am Ring stattfindenden Reaktionen zugeschrieben werden konnten. Das Metabolitenspektrum, das in den Untersuchungen mit Phenylalkanen und aromatischen Säuren ermittelt wurde, glich im Allgemeinen dem von T. asahii. Filamentöse Pilze 1. Mit Ausnahme von Penicillium chrysogenum zeigten alle Stämme der getesteten filamentösen Pilze die Fähigkeit zum Wachstum mit Phenyldodecan. Eine besonders starke Zunahme der Biomasse war dabei mit Sporothrix nivea SBUG M 35 und Umbelopsis isabellina SBUG M 1145 zu verzeichnen. Phenylalkane mit kürzeren Alkylseitenketten konnten von den meisten der untersuchten Pilze kaum bzw. nicht als Wachstumssubstrate genutzt werden. 2. In Biotransformationsexperimenten mit C. elegans, M. hiemalis und U. isabellina konnten 5 neuartige Metaboliten identifiziert werden: Zimtaldehyd, Zimtalkohol, Phenylpropanol und Benzylalkohol (deren Bildung wird auf reduktive Reaktionen der entsprechenden Carbonsäuren zurückgeführt) sowie ein Glycinamid der Zimtsäure, das eine Art Konjugat darstellt. 4. Während der Inkubation der filamentösen Pilze Sp. nivea SBUG-M 25 und SBUG M 242 sowie C. elegans und U. isabellina mit Phenylheptan wurde – analog zu Versuchen mit T. asahii - auch 4 Hydroxycumarin als Metabolit nachgewiesen.
  • Aim of the present study was to investigate the degradation of phenylalkanes by eukaryotic microorganisms, especially fungi. Major interest of this study was directed to the yeast Trichosporon asahii SBUG-Y 833. Further analysis were carried out with Candida maltosa SBUG-Y 700, Trichosporon mucoides SBUG-Y 801, and nine filamentous fungi of the genera Cunninghamella, Fusarium, Lecanicillium, Mucor, Penicillium, Sporothrix and Umbelopsis. Phenylalkanes were used as substrates with five to ten and twelve carbon atoms in the alkyl side chain. To characterize the degradation and transformation capacities of the yeasts, especially of T. asahii, biotransformation experiments with phenylalkane derivatives and aromatic acids were additionally carried out. Candida maltosa 1. The alkane-assimilating yeast C. maltosa was able to use phenylalkanes (0.5 %) with side chain length of at least 8 carbon atoms as growth substrates. 2. In biotransformation experiments with odd-chain phenylalkanes (phenylheptane, phenylnonane) benzoic acid was continuously extracellularly accumulated. Phenylalkanes with an even number of carbon atoms in the alkyl side chain (phenylhexane, phenyloctane, phenyldecane and phenyldodecane) were degraded via 4 phenylbutanoic acid and 4-phenyl-3-butenoic acid to phenylacetic acid which was accumulated extracellularly analogous to benzoic acid. 3. C. maltosa is not capable to further oxidize benzoic acid and phenylacetic acid. Therefore these acids accumulated as dead-end products during the phenylalkane degradation. Trichosporon asahii 1. In growth experiments, T. asahii was able to assimilate n-alkanes (n-dodecane, n-tetradecane, n-hexadecane) and phenylalkanes with at least seven carbon atoms in the alkyl side chain. 2. In biotransformation experiments with resting cells and phenylheptane as substrate, nine products were detected and identified by HPLC, GC-MS and NMR analysis: 7-phenylheptanoic acid, 7 (2-hydroxyphenyl)-heptanoic acid, 3 (2 hydroxyphenyl)-propionic acid, benzoic acid, 3,4-dihydroxybenzoic acid, coumarin, 4-hydroxycoumarin, 4,6-dihydroxy- and 4,8-dihydroxycoumarin. 2 hydroxyphenylheptanoic acid, 2 hydroxyphenylpropionic acid and the coumarins were described here for the first time as metabolites in degradation pathway of phenylalkanes. 3. The hydroxylated coumarins 4-hydroxy-, 4,6-dihydroxy- and 4,8 dihydroxycoumarin were continuously accumulated in contrast to the other six metabolites which were only transiently excreted by the yeast. The incubation of T. asahii with phenyloctane led only to prove of the hydroxylated coumarins. In biotransformation experiments with phenylnonane, phenyldecane and phenyldodecane 4 hydroxycoumarin was the only detectable metabolite. Typical degradation products such as benzoic acid and phenylacetic acid known from other yeasts, were not accumulated by T. asahii. 4. The formation of 4-hydroxycoumarin was also proved in biotransformation experiments with phenylheptanoic acid, 2-hydroxyphenylpropionic acid, trans-2-hydroxycinnamic acid and coumarin as substrates. The transformation of the two ortho-hydroxylated acids to 4 hydroxycoumarin resulted in product yields of about 70 %, whereas only 9.4 % of phenylheptanoic acid and 13 % of coumarin were transformed to this hydroxylated coumarin. 5. Due to the medical importance of coumarins, the formation of coumarins from 2,4-dihydroxyphenylpropionic and 7 hydroxycoumarin as precursor substrates was analyzed. Thereby, after incubation of the yeast with 2,4 dihydroxyphenylpropionic acid and 7 hydroxycoumarin the transformation product 4,7 dihydroxycoumarin was proved, and additionally 6,7 dihydroxycoumarin as a further one was identified in biotransformation experiments with 7 hydroxycoumarin. A 20-fold increase of 6,7 diydroxycoumarin accumulation was achieved by using phenol-cultivated yeast cells, suggesting the involvement of an inducible phenol hydroxylase. 6. By the use of the cytochrome P450 inhibitor 1 aminobenzotriazol the involvement of cytochrome P450 enzymes in ortho-hydroxylation of the benzene moiety of phenylalkanes and aromatic acids was considered. This reaction is in addition to the introduction of a double bond in the alkyl side chain essential for the biosynthesis of coumarins. 7. Using the phenylalkane derivative 1 phenylheptane 1-on as substrate, subterminal oxidation was observed yielding to degradation products with hydroxy- or keto-groups located at ω-1, ω-2 and ω-3 position. For yeasts, it was the first time demonstrated a subterminal oxidation of saturated alkyl chains. Trichosporon mucoides 1. In growth experiment, it was shown that the yeast T. mucoides is not able to assimilate n-alkanes (n-dodecane, n-tetradecane, n-hexadecane). The cultivation with phenylalkanes led only to a small but significant increase of biomass in case of phenylnonane and phenyldecane. 2. Although T. mucoides did not utilize n alkanes, metabolites of phenylalkane degradation were detected which formation could be attributed to terminal and ß oxidation reactions and furthermore, to subterminal attack and oxidation of the benzene moiety, as well. Filamentous fungi 1. With the exception of P. chrysogenum all tested strains of filamentous fungi showed the ability to grow with phenyldodecane. A particularly strong increase of biomass was observed with S. nivea SBUG-M 35 and U. isabellina SBUG 1145. Phenylalkanes with shorter alkyl side chains were little or not used as growth substrates. 2. During the incubation of the filamentous fungi C. elegans, M. hiemalis and U. isabellina with phenylheptane five novel metabolites could be identified: cinnamyl alcohol, cinnamaldehyde, benzyl alcohol, phenylpropanol which formation could be attributed to reductive reactions of the corresponding carboxylic acids, and at least a glycine amide of cinnamic acid as a kind of amino acid conjugate. 3. The fungi S. nivea, C. elegans and U. isabellina were – analogous to T. asahii –able to form 4 hydroxycoumarin in biotransformation experiments with phenylheptane (and partly phenyloctane and phenylnonane).

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Metadaten
Author: Susanne Awe
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000759-5
Title Additional (English):Degradation of phenylalkanes and further alkylsubstituted aromatics by yeasts and filamentous fungi
Advisor:Prof. Dr. Frieder Schauer
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2010/02/24
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2009/12/04
Release Date:2010/02/24
Tag:4-Hydroxycoumarin, Cumarine, Erdöl-Kohlenwasserstoffe, Phenylalkane, Schadstoffabbau, filamentöse Pilze
coumarin, coumarins
GND Keyword:Hefeartige Pilze, Trichosporon
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie