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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001092-6

Physiological, molecular and biochemical characterization of rodent extraocular muscles: Implications for Duchenne Muscular Dystrophy

  • The six extraocular muscles (EOMs) are arranged around the eyeball as agonist-antagonist pairs performing the eye movements. The EOMs comprise a distinct muscle group that is fundamentally different from other skeletal muscle, which is reflected on many levels, such as functionality, anatomy as well as in their molecular make-up. Physiologically EOMs are considered superfast, high endurance muscles that are continuously active. In addition, EOMs contain unusual slow-tonic fibers that share features with amphibian and avian slow-tonic fibers. EOMs also express slow/cardiac isoforms of proteins and genes along with the typical isoforms of fast muscle fibers. Another striking hallmark of EOM is their differential involvement in a number of diseases. For instance, EOMs are preferentially spared in Duchenne Muscular Dystrophy (DMD). DMD is the most common fatal, genetic disease in males clinically characterized by progressive muscle wasting. Mutations in the dystrophin gene result in a destabilization of the muscle membrane causing muscle fiber damage. While all other skeletal muscles deteriorate the EOMs remain morphologically and functionally healthy. In the pathogenesis of DMD elevated Ca2+ levels are believed to be an early event and it has been shown that EOMs are protected from pharmacologically induced Ca2+ damage. The goal of this study was to characterize the spared EOMs, in particular their Ca2+ homeostasis, in the context of DMD pathology to reveal new potential therapeutic targets for the disease. A combination of physiological, molecular and biochemical methods was used to investigate the Ca2+ homeostasis of EOMs to demonstrate clear differences compared with the fast limb muscle tibialis anterior (TA). Ca2+ handling of stimulated cultured EOM myotubes suggested more efficient Ca2+ removal from the cytoplasm after induced Ca2+ influx compared with cultured myoblasts from TA. Subsequent mRNA and protein expression analyses of myoblasts and adult muscle tissue revealed high expression levels of many key Ca2+ regulating and buffering proteins in rodent EOMs compared with TA. Among these Ca2+ proteins were slow/cardiac proteins, which normally are not found in fast muscles. For instance, the sarcoplasmic Ca2+ ATPase SERCA2 was elevated along with its regulator phospholamban (PLN). Further, PLN was preferentially endogenously phosphorylated at Thr17 suggesting continuous activation of SERCA2 and possibly the fast isoform SERCA1, the main Ca2+ pumps responsible for removing Ca2+ from the cytoplasm after muscle contraction. Furthermore, Ca2+ buffers, such as calsequestrin (CASQ2) and parvalbumin (PARV) were elevated. These results suggest that EOMs are endowed with a unique and superior Ca2+ homeostasis that facilitates efficient Ca2+ buffering and removal from the cytoplasm. This is in agreement with their continuous and fast activation cycles, as well as with a potential protective mechanism in prevention of Ca2+ overload in DMD. The extreme activity patterns of EOM suggested that a high activity of store-operated Ca2+ entry (SOCE) plays a critical part to replenish Ca2+ for rapid and continuous cycles of contractions. To extend the data on general Ca2+ homeostasis and because of possible implications of store-operated Ca2+ influx and other Ca2+ influx pathways in DMD, the expression patterns of group 1 transient receptor potential (TRP) channels and the proteins Orai1 and STIM1 were studied. The TRP channels, TRPC1, TRPC6 and TRPV4 channel proteins in addition to STIM1 showed higher expression in EOM compared with TA. High TRPC1, TRPV4 and STIM1 levels could play a significant role in the high fatigue resistance, muscle differentiation and SOCE in EOM. In addition, tissue from the mdx mouse model of DMD was investigated. The only channels differentially expressed in mdx EOM compared with normal EOM were TRPM4 and TRPM7 (decreased in mdx EOM) and TRPV4 (increased in mdx EOM). Although, these changes in mdx EOM were of small magnitude, they could point toward subtle compensatory changes related to the disease process. In general, EOMs seem to be unaffected by the disease and inherently protected. In conclusion, the results in this thesis have improved the understanding of the Ca2+ homeostasis in EOMs and suggest that EOM may be better able to prevent prolonged elevation of cytoplasmic Ca2+ levels. These data may help to design new therapeutic approaches targeting Ca2+ handling proteins to ameliorate muscular dystrophy.
  • Die sechs äußeren Augenmuskel (extraocular muscles – EOMs) sind als Agonisten-Antagonistenpaare um den Augapfel herum angeordnet um die Augenbewegungen auszuführen. Sie representieren eine eigene Muskelgruppe, welche fundamental verschieden ist von anderen Skelettmuskeln. Dies spiegelt sich auf vielen Ebenen, wie zum Beispiel in ihrer Funktionalität, Anatomie und auch im molekularen Aufbau wieder. Physiologisch werden die EOMs als superschnelle, hochausdauernde und kontinuierlich aktive Muskeln angesehen. Die EOMs enthalten langsam-tonische Fasern, die Ähnlichkeiten mit langsam-tonischen Fasern von Amphibien und Vögeln haben. Außerdem exprimieren die EOMs, neben den typischen Isoformen von schnellen Muskelfasern, langsam/kardiale Proteinisoformen und Gene. Ein weiteres auffälliges Merkmal der EOMs ist Ihre differenzielle Beteiligung bei einigen Krankheiten. Zum Beispiel sind EOMs von der Duchenne Muskeldystrophie (DMD) nicht betroffen. DMD ist die häufigste, tödlich-verlaufende, genetische Erkrankung bei Jungen, welche sich klinisch durch progressiven Muskelverlust auszeichnet. Mutationen im Dystrophingen führen zu einer Destabilisierung der Muskelmembran was eine Muskelfaserschädigung zur Folge hat. Während andere Skelettmuskeln zu Grunde gehen, bleiben die EOMs morphologisch und funktionell unbehelligt. In der DMD Pathogenese spielen wahrscheinlich erhöhte Calcium (Ca2+)-Spiegel eine frühe Rolle und es wurde gezeigt, daß die EOMs gegen pharmakologisch induzierte Ca2+-Schädigung geschützt sind. Das Ziel dieser Arbeit war es die EOMs im Zusammenhang mit DMD hinsichtlich Ihrer Ca2+-Homöostase zu charakterisieren, um potentielle neue therapeutische Ansatzpunkte zu aufzudecken. Eine Kombination aus physiologischen, molekularen und biochemischen Methoden wurde genutzt, um die Ca2+-Homöostase der EOMs zu untersuchen, wobei klare Unterschiede zu dem schnellen Beinmuskel tibialis anterior (TA) herausgestellt wurden. Effektive Kontrolle von Ca2+-Transienten in stimulierten kultivierten Augenmuskelmyotuben deutete auf effizientere Beseitigung von Ca2+ aus dem Zytoplasma nach induziertem Ca2+-Einstrom im Vergleich mit kultivierten TA-Myotuben hin. Nachfolgende mRNA- und Proteinexpressionsanalysen in Myotuben und ausgereiftem Muskelgewebe zeigten hohe Expression vieler Ca2+-regulatorischer und -puffernder Proteine in Nager EOMs im Vergleich mit TA. Dazu gehörten langsam/kardiale Ca2+-Proteine, welche normalerweise nur in schnellen Muskeln zu finden sind. Zum Beispiel, war die sarkoplasmatische Ca2+ ATPase SERCA2 zusammen mit Ihrem Regulator Phospholamban (PLN) erhöht. Weiterhin war PLN endogen an Thr17 phosphoryliert was auf eine konstante Aktivierung der SERCA Ca2+-Pumpen hinweist, welche hauptverantwortlich für die rasche Entfernung von Ca2+ aus dem Zytoplasma nach der Muskelkontraktion sind. Zusätzlich zeigten Ca2+-Pufferproteine wie Calsequestrin (CASQ2) und Parvalbumin (PARV) eine höhere Expression. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß EOMs mit einer einzigartigen und überlegenen Ca2+-Homöostase ausgestattet sind, welche effiziente Ca2+-Pufferung and -Entfernung aus dem Zytoplasma ermöglicht. Dies ist im Einklang mit konstanter und schneller Aktivität und stellt einen potentiell protektiven Mechanismus gegen Ca2+-Überladung bei DMD dar. Die extremen Aktivitätsmuster der EOMs weisen darauf hin, daß der sogenannte speicher-gesteuerte Ca2+-Einstrom oder store-operated Ca2+ entry (SOCE) eine wichtige Rolle bei der Wiederbereitstellung von Ca2+ während rascher und konstanter Kontraktionsyzklen spielen könnte. Um die bisherigen Daten zur allgemeinen Ca2+-Homöostase zu erweitern und um eine mögliche Rolle des SOCE oder anderer Ca2+-Einstromwege in der DMD aufzuklären, wurden die Expressionsmuster der Gruppe 1 transient receptor potential (TRP) Kanäle und die Proteine Orai1 und STIM1 untersucht. Die TRP Kanäle TRPC1, TRPC6 und TRPV4 Kanalproteine sowie STIM1 zeigten höhere Expression in EOMs im Vergleich zu TA. Ein höherer Gehalt an TRPC1, TRPV4 und STIM1 könnte in EOMs zu der höheren Fatigueresistenz, sowie zur Muskeldifferenzierung und zu dem SOCE signifikant beitragen. Zusätzlich wurde Gewebe der mdx Maus, dem DMD Mausmodell untersucht. Die einzigen Kanäle, die in mdx EOMs differenzielle Expression zeigten, waren TRPM4 und TRPM7 (erniedrigt in mdx EOMs) und TRPV4 (erhöht in mdx EOMs). Obwohl diese Unterschiede in mdx EOMs gering waren, könnten sie auf subtile kompensatorische Veränderungen aufgrund der Krankheit hinweisen. Im Allgemeinen deuten die Ergebnisse aber darauf hin, daß EOMs inhärent vor dystrophischen Veränderungen geschützt sind. Die Ergebnisse hinsichtlich der Ca2+-Homöostase der EOMs weisen darauf hin, daß die EOMs in der Lage sind, einem anhaltend erhöhten zytoplasmatischen Ca2+-Gehalt entgegenzuwirken. Diese Daten könnten zu neuen therapeutischen Ansätzen im Bereich der Ca2+-bindenden Proteine zur Besserung der Muskeldystrophie führen.

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Metadaten
Author: Ulrike Zeiger
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001092-6
Title Additional (German):Physiologische, molekulare und biochemische Charakterisierung der Augenmuskeln von Nagern: Folgerungen für die Muskeldystrophie Duchenne
Advisor:Prof. Dr. Heinrich Brinkmeier
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2011/11/03
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2011/10/04
Release Date:2011/11/03
Tag:Augenmuskeln, SERCA, STIM1, TRP Kanäle, mdx Maus
TRP channels, calcium homeostasis, extraocular muscles
GND Keyword:Calcium, Calcium-ATPasen, Calciumhomöostase, Duchenne-Syndrom, Phospholamban, Quergestreifte Muskulatur
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Pathophysiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie