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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001136-2

Untersuchungen zum intrazellulären Transport des Pseudorabies Virus

  • Der effiziente intrazelluläre Transport viraler Nukleokapside ist eine grundlegende Voraussetzung für eine erfolgreiche Virusinfektion. Aufgrund seiner engen Verwandtschaft zum humanpathogenen Herpes Simplex Virus 1 (HSV-1) und seiner Eigenschaft zur einfachen gentechnischen Veränderung stellt das Pseudorabies Virus (PrV) ein geeignetes Modell zur Untersuchung molekularer Mechanismen der Replikation und des Neurotropismus von Herpesviren dar. Der intrazelluläre Transport herpesviraler Kapside erfolgt aktiv entlang von Mikrotubuli durch zelluläre Motorproteinkomplexe. Die hieran beteiligten viralen Proteine konnten bisher jedoch nicht eindeutig identifiziert werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Funktionen viraler Proteine im intrazellulären Transport von PrV. In erster Linie wurde die Rolle von PrV pUL35 und pUL37 untersucht, die auf intrazytoplasmatischen Kapsiden an der Oberfläche liegen und der Interaktion mit zellulären Proteinen zugänglich sind. Neben der Charakterisierung der Virusreplikation nach Deletion der einzelnen Gene in vitro und in vivo wurde auch der intrazelluläre Transport von GFP-markierten Mutanten zum Zellkern untersucht. In einem weiteren Teil der Arbeit wurden Kapsid- und eng mit dem Kapsid assoziierte Proteine in yeast two-hybrid Studien analysiert, um virale und zelluläre Interaktionspartner zu identifizieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen sich wie folgt zusammenfassen: (1) PrV pUL35 und pUL37 sind für die Virusreplikation in vitro nicht essentiell. Die Replikation von UL35- bzw. UL37-Mutanten war jedoch vermindert. In Abwesenheit von funktionellem pUL35 und pUL37 gleichzeitig trugen die beiden Mutationen unabhängig voneinander zu einem verstärkten Phänotyp bei. Beide Proteine scheinen demnach in unterschiedliche Prozesse der Virusreplikation involviert zu sein. (2) Die N-terminale EGFP-Fusion von pUL35 zum Zweck der Fluoreszenzmarkierung viraler Kapside resultierte im Funktionsverlust des Proteins. Die Inkorporation in Kapside wurde aber nicht beeinträchtigt. Für die Interaktion von PrV pUL35 mit dem Kapsid könnte der konservierte C-Terminus des Proteins relevant sein. (3) Auch in Abwesenheit eines funktionellen pUL35 werden PrV Kapside effizient transportiert. PrV pUL35 kommt somit keine entscheidende Rolle beim intrazellulären Transport viraler Nukleokapside zu. Die verzögerte Neuroinvasion von UL35-Mutanten in vivo lässt jedoch eine möglicherweise akzessorische Funktion von pUL35 vermuten. (4) PrV pUL37 ist für den intrazellulären Transport viraler Nukleokapside nicht essentiell, erhöht jedoch deutlich dessen Effizienz. Der positive Einfluss auf den retro- und anterograden Transport viraler Kapside lässt darauf schließen, dass pUL37 in Transportprozesse während des Viruseintritts und der Freisetung involviert ist. (5) Der N-Terminus von PrV pUL36 interagierte im yeast two-hybrid System mit den Untereinheiten Rp3, LC8 und Tctex1 des Dynein-Motorproteinkomplexes. PrV pUL36 könnte daher für den MT-abhängigen Transport viraler Nukleokapside relevant sein.
  • One of the most important requirements for a successful infection is an efficient intracellular transport of viral nucleocapsids. Because of its close relationship to the human pathogenic Herpes Simplex Virus 1 (HSV-1) and its simple accessibility for introduction of genetic modifications Pseudorabies virus (PrV) has become an important model to study basic processes during herpesvirus replication and molecular mechanisms in herpesvirus neurotropism. Intracellular transport of herpesvirus capsids is carried out along microtubules and is driven by cellular motor proteins. However, viral proteins that are involved in this process have not been clearly identified so far. The purpose of this study was the analysis of the function of viral proteins in intracellular transport of PrV. Because of their location on the surface of cytoplasmic capsids pUL35 and pUL37 are likely available for interactions with cellular proteins and were therefore studied in detail. In addition to the characterization of virus replication in absence of these proteins the intracellular transport of GFP-tagged mutants was analysed in vitro and in vivo. Continuing this study and to identify new viral and cellular interaction partners capsid and capsidassociated proteins were investigated by yeast two-hybrid analyses. The results of this study can be summarized as follows: (1) PrV pUL35 and pUL37 are not essential for virus replication in vitro, but replication efficiency of the UL35 or UL37 mutant was reduced. In the simultaneous absence of functional pUL35 and pUL37 both mutations caused independently an enhanced phenotype. Therefore, both proteins seem to be involved in different processes of virus replication. (2) The N-terminal fusion of EGFP to pUL35 for fluorescent labelling of viral capsids resulted in the loss of protein function, although incorporation into capsids was unaffected. Therefore, the conserved C-terminal domain of PrV pUL35 could be relevant for the interaction with the capsid. (3) Intracellular transport of PrV capsids was efficient even in the absence of functional pUL35 but neuroinvasion of the UL35 mutant was slightly reduced. Thus, pUL35 may have an accessory function in intracellular transport of PrV. (4) PrV pUL37 is not essential for cellular trafficking of viral capsids but increases its efficiency indicating a functional role of pUL37 during entry and egress of PrV. (5) The N-terminal domain of pUL36 was shown to interact with the subunits Rp3, LC8 and Tctex1 of the Dynein motor complex. Therefore, pUL36 might be involved in linking viral capsids to cellular proteins of the MT-based transport machinery.

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Metadaten
Author: Mirjam Krautwald
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001136-2
Title Additional (English):Analysis of intracellular transport of Pseudorabies virus
Advisor:Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas C. Mettenleiter
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2011/12/19
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2011/09/30
Release Date:2011/12/19
Tag:Herpesvirus, PrV, intrazellulärer Transport, pUL35, pUL37
PrV, herpesvirus, intracellular transport, pUL35, pUL37
GND Keyword:Molekulare Virologie
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie
MSC-Classification:92-XX BIOLOGY AND OTHER NATURAL SCIENCES / 92Cxx Physiological, cellular and medical topics / 92C40 Biochemistry, molecular biology