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Sebastian Schätzle

• In this thesis, two novel assay systems had been developed, which allow a fast and easy screening for amine transaminase activity as well as the characterization of the amino donor and acceptor specificity of a given amine transaminase. The assays overcome some limitations of previously described assays but of course have some limitations themselves. The relatively low wavelength of 245 nm, at which the production of acetophenone is detected with the spectrophotometric assay, limits the amount of protein/crude extract that can be applied, which eventually results in a decreased sensitivity at higher enzyme loads due to an increased initial absorbance. Otherwise, this assay can be used very easily for the investigation of the amino acceptor specificity and both pH and temperature dependencies of amine transaminases. The conductometric assay is – by its very nature – limited to low-conducting buffers, a neutral pH and constant temperatures. In summary, the assays complement one another very well and the complete characterization of the most important enzyme properties can be accomplished quickly. Furthermore, we developed and applied a novel in silico search strategy for the identification of (R)-selective amine transaminases in sequence databases. Structural information of probably related proteins was used for rational protein design to predict key amino acid substitutions that indicate the desired activity. We subsequently searched protein databases for proteins already carrying these mutations instead of constructing the corresponding mutants in the laboratory. This methodology exploits the fact that naturally evolved proteins have undergone selection over millions of years, which has resulted in highly optimized catalysts. Using this in silico approach, we have discovered 17 (R)-selective amine transaminases. In theory, this strategy can be applied to other enzyme classes and fold types as well and for this reason constitutes a new concept for the identification of desired enzymes. Finally, we applied the seven most promising candidates of the identified proteins to asymmetric synthesis of various optical pure amines with (R)-configuration starting from the corresponding ketones. We used a lactate dehydrogenase/glucose dehydrogenase system for the necessary shift of the thermodynamic equilibrium. For all ketones at least one enzyme was found that allowed complete conversion to the corresponding chiral amine with excellent optical purities >99% ee. Bearing in mind that until last year there was only one (R)-selective amine transaminase commercially available and two microorganisms with the corresponding activity described, the identification of numerous enzymes is a breakthrough in asymmetric synthesis of chiral amines.
• Bei der Etablierung effizienter biotechnologischer Prozesse spielt die Identifizierung neuer Biokatalysatoren und deren Optimierung eine wichtige Rolle. Die biochemische Charakterisierung eines Enzyms und Untersuchungen zum Substratspektrum und zur Enantioselektivität sind dabei unerlässlich. Der spektrophotometrische Assay basiert auf der Reaktion des häufig verwendeten Modell-Substrats alpha-Methylbenzylamin zu Acetophenon. Das Produkt dieser Reaktion kann spektrophotometrisch bei 245 nm mit hoher Sensitivität detektiert werden (e = 12 mM-1cm-1). Damit ermöglicht der Assay eine sehr schnelle Charakterisierung des Aminoakzeptor-Spektrums von Amin-Transaminasen. Weiterhin können Eigenschaften wie pH- und Temperatur-Optima und die Stabilität eines Enzyms sehr einfach untersucht werden (Artikel I). Anschließend wurde ein Assay-System zur ähnlich einfachen Charakterisierung des Aminodonor-Spektrums entwickelt (Artikel II). Dieser Assay beruht auf der Messung der Leitfähigkeit: der Verlauf einer Transaminierungs-Reaktion lässt sich konduktometrisch verfolgen, da zwei geladene und damit leitende Substrate zu zwei nicht-leitenden Produkten umgesetzt werden. Im Unterschied zu früheren Assay-Systemen kann mit dieser konduktometrischen Methode jeder Aminodonor und -akzeptor als Substrat untersucht werden, solang einer von beiden eine Amino- bzw. Ketosäure ist. Ein wichtiges Kriterium hinsichtlich der Anwendung eines Enzyms in einem biotechnologischen Verfahren ist seine Enantiopräferenz und -selektivität. Die verschiedenen Konzepte und Strategien zur Bereitstellung gewünschter Biokatalysatoren wurden in einem Übersichtsartikel (Artikel III) zusammengefasst und an ausgewählten Beispielen erläutert. Artikel IV beschreibt eine neue Herangehensweise zum Auffinden von Enzymen mit erwünschten Charakteristika wie Substratspezifität und Enantiopräferenz. Diese Strategie besteht im Wesentlichen aus vier Schritten: (i) zunächst wurden Kristallstrukturen verschiedener Aminosäure-Transaminasen untersucht, um mögliche Vorfahren der gewünschten (R)-selektiven Amin-Transaminase zu identifizieren. (ii) Des Weiteren wurden anhand der strukturellen Informationen analog zum rationalen Proteindesign Aminosäurereste lokalisiert, welche zur Substratbindung im aktiven Zentrum beitragen. Für eben diese Posit ionen wurden dann Mutationen vorhergesagt, die als entscheidend für die gewünschte Substratspezifität und Enantiopräferenz erachtet wurden. (iii) Anschließend wurden mit Hilfe von multiplen Sequenz-Alignments Sequenz-Motive in Enzymen dieser Faltungsklasse identifiziert, um in der späteren Datenbanksuche unerwünschte Substratspezifitäten und Enzymaktivitäten ausschließen zu können. Aus der Kombination dieser Sequenz-Motive und den vorhergesagten Punktmutationen wurde dann der eigentliche Such-Algorithmus entwickelt. (iv) Schließlich wurden etwa 5000 Proteinsequenzen in silico durchmustert und 21 Sequenzen potentieller (R)-selektiver Amin-Transaminasen gefunden. Die synthetischen Gene dieser Proteine wurden in E. coli kloniert und die Enzyme nach rekombinanter Expression affinitätschromatographisch aufgereinigt. Die anschließende Charakterisierung mit Hilfe der oben beschriebenen Assays zeigte, dass alle 17 erfolgreich exprimierten Enzyme tatsächlich Amin-Transaminase-Aktivität und die gewünschte (R)-Präferenz zeigten. Schlussendlich wurden die sieben vielversprechendsten Enzyme - beurteilt nach ihrer spezifischen Aktivität und Expressionslevel - näher auf ihre Eigenschaften und ihr Potential hinsichtlich ihrer Anwendung in der asymmetrischen Synthese chiraler Amine untersucht (Artikel V). Nach einigen Optimierungen konnten mit den neuen (R)-selektiven Transaminasen 12 verschiedene aliphatische, aromatische und arylaliphatische Amine mit exzellenten Ausbeuten (>99%) in ausgezeichneter optischer Reinheit (>99,9% ee) hergestellt werden.