• search hit 4 of 182
Back to Result List

Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001198-8

Deciphering Streptococcus pneumoniae induced host cell signaling during internalization and calcium release from intracellular stores

  • Streptococcus pneumoniae (pneumococci) are Gram-positive cocci and commensals of the human upper respiratory tract. Pneumococcal pathogenesis requires adherence to host cells and dissemination through cellular barriers and to evade host defense mechanisms. The Pneumococcal surface protein C (PspC) is an important virulence factor which has a crucial role in pneumococcal adhesion to host cells and immune evasion by manipulating the host complement system. To elucidate the pneumococcal adherence and uptake mechanism via factor H glycosaminoglycans (dermatan sulfate and heparin) were employed as competitive inhibitors in infection experiments with epithelial cells or human polymorphonuclear leukocytes (PMNs). Glycosaminoglycans significantly inhibited the FH mediated pneumococcal adherence and subsequent invasion to host epithelial cells. Furthermore, the short consensus repeats of FH which promotes the adhesion of pneumococci to host cells were identified by blocking experiments with domain mapped antibodies for specific regions of FH. Moreover, this study indicates that FH acts as adhesion molecule via cellular receptors recognized as integrin CR3 on human PMNs. Binding of Factor H loaded pneumococci to integrins CR3 was assessed by flow cytometry. Pneumococci coated with Factor H showed a significantly increased association with PMNs. This interaction was blocked by anti-CR3 antibodies and Pra1. This project further aims to study mechanisms of pneumococcal endocytosis by host cells, their intracellular fate, and the pathogen induced host cell signal transduction cascades including the calcium signaling upon pneumococcal infection of host cells via the PspC-hpIgR interaction. To assess now the role of protein tyrosine kinases (PTKs) during pneumococcal infection via PspC, cell culture infections were performed in presence of pharmacological inhibitors of PTKs and MAPKs or by employing genetic interference techniques. Blocking the function of Src or ER1/2 and JNK and genetic-knock down of Src and FAK reduced significantly internalization of pneumococci. These data indicated the importance of a coordinated signaling between Src PTKs, ERK1/2, and JNK during PspC-pIgR-mediated uptake of pneumococci by host epithelial cells. The impact of host cells intracellular calcium concentrations on pneumococcal PspC-hpIgR mediated internalization was studied. Intracellular calcium measurement of epithelial cells performed in the presence of pneumococci suggested a calcium influx in host epithelial cells and importantly this calcium influx was PspC- hpIgR specific as pspC-deficient pneumococci were unable to mediate calcium mobilization in host cells. The increase in intracellular calcium [Ca2+]i was dependent on phospholipase C as pretreatment of cells with a phospholipase C-specific inhibitor abolished the increase in [Ca2+]i. Furthermore, role of host intracellular calcium concentrations during pneumococcal internalization was demonstrated by employing specific pharmacological inhibitors and calcium chelators in epithelial cell culture infection assays. The results revealed that elevated host cells calcium concentrations diminished pneumococcal internalization while lower calcium concentration in host epithelial cells promoted pneumococcal uptake. This study further demonstrates that dynamin, clathrin and caveolin play a key role during pneumococcal endocytosis into host cells via PspC-hpIgR. The use of specific pharmacological inhibitors or genetic interference approaches against dynamin, clathrin and caveolin in epithelial cell culture infection assays significantly blocked pneumococcal uptake. Furthermore, confocal microscopy revealed that pneumococci co-localize with clathrin. At later stages of the infection the pathogen is sorted to early, late and recycling endosomes as indicated by co-localization of pneumococci with endosomal markers such as Rab5, Rab4, Rab 7, and Lamp1. In order to get further insights into PspC-hpIgR mediated uptake mechanisms, a chimeric PspC was constructed and expressed heterologously on the surface of Lactococcus lactis. Immunofluorescence staining, immunoblot and flow cytometric analysis of L. lactis confirmed the expression of PspC on the bacterial surface. Moreover the ability of recombinant lactococci expressing PspC to adhere to and to invade pIgR-expressing epithelial cells confirmed the functional activity of PspC when exposed on the lactococcal surface. PspC expressing lactococci confirmed the specificity of PspC-hpIgR mediated endocytosis in host epithelial cells as PspC deficient lactococci were not taken up by these host cells. Confocal microscopic analysis demonstrated that only PspC expressing lactococci were sorted to early, late and recycling endosomes, similar to the intracellular fate of S. pneumoniae.
  • Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) sind Gram-positive kokkoide kommensale Bakterien des oberen Atemweges des Menschen. Pneumococcal Pathogenese erfordert eine Anheftung der Bakterien an die Wirtzellen und ein Durchqueren zellulärer Barrieren oder die Aufnahme durch Wirtszellen. Ein wichtiger Virulenzfaktor von essentieller Bedeutung für die Anheftung der Pneumokokken an ihre Wirtszellen und die Umgehung des Immunsystems durch Manipulation des Komplementsystems des Wirtes repräsentiert das „Pneumokokken-Surface Protein C“ (PspC). Um den FH-vermittelten Anheftungs- und Aufnahmemechanismus der Pneumokokken in Epithelzellen oder in menschliche polymorph kernige Leukozyten (PMN) zu untersuchen, wurden Glukosaminoglykane (Dermatansulfat und Heparin) als kompetitive Inhibitoren in Infektionsexperimenten verwendet. Es zeigte sich, dass Glukosaminoglykane diese Prozesse signifikant mindern konnten. Des Weiteren konnten die short consensus repeats des Factor H Moleküls, die die Anheftung der Pneumokokken an die Wirtszellen fördern, mit Hilfe von Antikörpern, die gegen spezifische Regionen von FH gerichtet sind, identifiziert werden. Die Ergebnisse offenbaren, dass die Heparinbinderegion SCR19-20 von FH den Kontakt zwischen Pneumokokken-gebundenem FH und der Wirtszelloberfläche herstellt. Außerdem deutet diese Studie darauf hin, dass FH über einen zellulären Rezeptor, auf humanen PMNs bekannt als Integrin CR3, als Adhäsionsmolekül agiert. Dazu wurde die Bindung von FH-beladenen Pneumokokken an das Integrin CR3 durchflusszytometrisch gemessen und festgestellt, dass FH-besetzte Pneumokokken eine signifikant erhöhte Assoziation mit PMNs zeigten. Diese Interaktion konnte mit anti-CR3-Antikörpern und dem CR3-Liganden Pra1. Ein weiteres Ziel dieser Studie war die Aufklärung der Endozytosemechanismen bei der Aufnahme der Pneumokokken in die Wirtszellen, ihr intrazelluläres Schicksal und die Pathogen-induzierten Signaltransduktion in den Wirtszellen, einschließlich der Kalzium-vermittelten Signaltransduktion während der PspC-pIgR-vermittelten Infektion der Wirtszellen mit Pneumokokken. Eine kürzlich veröffentlichte Studie deutet auf eine Aktivierung und Kooperation zwischen Cdc42, einer GTPase der Rho-Familie, der Phosphoinositol-3-Phosphat-Kinase (PI3-Kinase) und der Proteinkinase B (Akt) beim Eindringen der Bakterien hin. Um das Mitwirken von Proteintyrosinkinasen (PTKs) und Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPK) bei einer Pneumokokkeninfektion via PspC zu untersuchen, wurden Zellkulturexperimente in Anwesenheit von pharmakologischen Inhibitoren und genetischer Interferenz durchgeführt. Der Einfluß der Kalziumkonzentration in der Wirtszelle auf die PspC-hpIgR-vermittelte Internalisierung der Pneumokokken wurde in dieser Studie untersucht, in dem die Konzentration des intrazellulären Kalziums ([Ca2+]i) in Epithelzellen in der Gegenwart von Pneumokokken gemessen wurde. Die Messungen weisen darauf hin, dass Kalzium in die Zellen strömt und dass dieser Kalziumeinstrom PspC-hpIgR-spezifisch ist, da pspC-defiziente Pneumokokken kein Kalzium mobilisieren konnten. Die Erhöhung des [Ca2+]i war abhängig von der Phospholipase C, da eine Vorbehandlung der Zellen mit einem Phospholipase C-spezifischen Inhibitor die Erhöhung der Kalziumkonzentration verhinderte. Außerdem wurde die Rolle des [Ca2+]i während der Pneumokokkeninternalisierung in epitheliale Zellkulturzellen durch die Verwendung spezifischer pharmakologischer Inhibitoren und Kalziumchelatoren im Infektionsexperiment nachgewiesen. Diese Arbeit veranschaulicht weiterhin, dass Dynamin, Clathrin und Caveolin eine Schlüsselrolle während der PspC-hpIgR-vermittelten Endozytose spielen. Durch die Verwendung spezifischer pharmakologischer Inhibitoren oder genetischer Interferenz gegen Dynamin, Clathrin und Caveolin konnte die Aufnahme von Pneumokokken in Infektionsexperimenten mit Epithelzellen signifikant unterbunden werden. Mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie wurde gezeigt, dass Pneumokokken mit Clathrin kolokalisieren und dass sie in späteren Stadien der Infektion in frühe, späte und Recycling-Endosomen geleitet werden, sichtbar an der Kolokalisation der Pneumokokken mit endosomalen Markern wie Rab5, Rab7 und Lamp1. Um einen weiteren Einblick in den PspC-hpIgR-vermittelten Aufnahmemechanismus zu erhalten, wurde ein chimäres PspC generiert und heterolog auf der Oberfläche von Lactococcus lactis exprimiert. Immunfluoreszenzfärbungen, Immunblots und die Analyse in der Durchflusszytometrie bewiesen die Expression von PspC auf der Bakterienoberfläche von L. lactis. Die PspC-hpIgR-Spezifität dieser Endozytose wurde dadurch bestätigt, dass rekombinante Laktokokken mit PspC auf ihrer Oberfläche nun in der Lage waren, sich an hpIgR-exprimierende Epithelzellen anzulagern und in diese einzudringen, während PspC-defiziente Laktokokken dies nicht konnten.

Download full text files

Export metadata

Additional Services

Share in Twitter Search Google Scholar
Metadaten
Author: Muhammad Tauseef Asmat
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001198-8
Title Additional (German):Die Untersuchung der Signalübertragung im Wirt während der Internalisierung und der Calcium Freisetzung aus intrazellulären Speichern verursacht durch Streptococcus pneumoniae
Advisor:Prof. Bernd Schmeck, Prof. Sven Hammerschmidt
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2012/12/21
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2012/03/16
Release Date:2012/12/21
Tag:Kalziumsignale, Pneumokokken, PspC, PspC-hpIgR-vermittelten Endozytose
Streptococcus pneumoniae
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Mikrobiologie - Abteilung für Genetik & Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie