• search hit 1 of 3
Back to Result List

Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001463-5

Globale Phosphoproteomanalyse Gram-positiver Bakterien unter besonderer Berücksichtigung regulatorischer Mechanismen

  • Die Analyse bakterieller Phosphoproteome rückt durch die Einflussnahme von Phosphorylierungsereignissen im Virulenzgeschehen pathogener Mikroorganismen immer weiter in den Vordergrund. Der Fokus dieser Arbeit lag auf der globalen Analyse bakterieller Phosphoproteome unter Anwendung verschiedener Techniken der Proteomforschung. Ziel war es, einen möglichst umfassenden Überblick über das cytosolische Phosphoproteom zu gewinnen, die Dynamik der Protein-Phosphorylierungen unter verschiedenen physiologischen Bedingungen zu analysieren und daraus folgend Hinweise auf regulatorische Mechanismen zu erhalten. Im Zuge der Untersuchungen zum Phosphoproteom von Bacillus subtilis wurde das auf den phosphosensitiven Pro-Q® Diamond-Farbstoff basierende 2D-Gel-Färbeprotokoll optimiert und validiert. Ferner wurde dieses Protokoll erfolgreich für die Untersuchungen des Phosphoproteoms von Mycoplasma pneumoniae und Staphylococcus aureus eingesetzt. Durch die Etablierung einer Methode zur Phosphopeptidanreicherung konnte der Blick auf das Gesamtphosphoproteom von S. aureus komplementiert werden. Insgesamt war es dadurch möglich, 103 phosphorylierte Proteine und 68 verschiedene Phosphorylierungsstellen von S. aureus zu identifizieren, darunter z. B. den Virulenzregulator SarA, dessen Phosphorylierung einen Hinweis auf seine mögliche Regulation aufzeigt. Zusätzlich konnten die Phosphorylierungsergebnisse der Fruktose-1,6-Bisphosphataldolase erste Hinweise auf eine Regulation der Substratbindung liefern und einen Erklärungsansatz enstehen lassen, der die Wirkungslosigkeit einiger in der Literatur beschriebenen Enzyminhibitoren (potentielle antimikrobielle Wirkstoffe) in in vivo Studien darlegt. In einem auf der Pro-Q® Diamond-Färbung beruhenden Quantifizierungsansatz konnten 10 signifikante Veränderungen in der Signalintensität der phosphorylierten Proteine unter Glukosehunger, nitrosativem, oxidativem und osmotischem Stress festgestellt werden. Diese liefern erste Indizien auf durch Phosphorylierungsereignisse gesteuerte Regulationsmechanismen. Besonders die unter nitrosativen Stress neu auftretenden putativ phosphorylierten Proteinspots der Proteine FdaB (Fruktose-Bisphosphataldolase) und HchA (molekulares Chaperon Hsp31/Glyoxalase 3) lassen Spekulationen über neue Stoffwechselwege, wie z. B. einen Methylglyoxal detoxifizierenden Mechanismus, zu. Darüber hinaus konnten durch die Glukosehungerexperimente und die Spezifizierung der Phosphorylierungsstelle T537 der Pyruvatkinase von S. aureus ein Regulationsmechanismus vorgeschlagen werden, der das "Finetuning" des Energieladungszustandes der Zelle über einen Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsmechanismus beschreibt. Von weiterem Interesse war die Identifizierung von am Arginin phosphorylierten Peptiden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde hierfür das Phosphopeptid-anreicherungsprotokoll optimiert, so dass in Zusammenarbeit mit A. Elsholz (Inst. f. Mikrobiologie, EMAU Greifswald) die Identifizierung von phosphorylierten Argininresten der Argininkinase McsB und der ATPase ClpC in B. subtilis möglich wurde. Darüber hinaus wurde die Methode in globalen Untersuchungen einer Phosphatasemutante (∆ywlE, B. subtilis) angewandt. Mittels der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten massenspektrometrischen Analyse der angereicherten Peptide konnten 111 Arginin-Phosphorylierungsstellen identifiziert werden. Zur Verbesserung der Quantifizierung von phosphorylierten Proteinen in B. subtilis wurde ein Protokoll entwickelt, indem das Auftrennungspotential des 2D-Gels, die Identifizierung phosphorylierter Proteine anhand des Pro-Q® Diamond-Farbstoffs und die auf die metabolische Markierung beruhende Quantifizierung miteinander kombiniert wurde. Im Ergebnis konnte anhand dieser Methode eine bessere Reproduzierbarkeit und eine höhere Sensitivität bei geringeren Veränderungen im Vergleich zu dem Pro Q® Diamond basierten Quantifizierungsansatz erzielt werden.
  • Analysis of bacterial phosphoproteomes becomes an increasing importance due to the influence of phosphorylation events during virulence of pathogenic microorganisms. The thesis presented here focuses on the global analysis of bacterial phosphoproteomes using different proteomic technologies. It was conducted in order to characterize phosphorylated proteins comprehensively, to investigate their dynamics under different physiological conditions and to obtain first insights in regulatory mechanisms. Therefore a 2D-gel protocol, based on the phosphosensitive stain Pro-Q Diamond, was optimized, validated and first applied for the analysis of the phosphoproteome of Bacillus subtilis. In the following work the resulting protocol was also applied for the investigation of the phosphoproteomes of the human pathogens Mycoplasma pneumoniae and Staphylococcus aureus. The establishment of the phosphopeptide enrichment protocol according to Olsen and Macek completed the analysis of the phosphoproteome of S. aureus. 103 phosphorylated proteins and 68 different phosphorylation sites from S. aureus were identified including two phosphosites in the virulence regulator SarA. The phosphorylation events of SarA provide a first hint of its putative control mechanism similar to that of the transcriptional regulator MgrA. Additionally, the identification of multiple phosphorylation sites and their structural localization in the FbaA-protein (fructose-1,6-bisphosphate aldolase) indicate an active regulation of the substrate binding. These findings provide first possible explanations for the inefficacy of substrate-analog FbaA-inhibitors in in vivo analysis experiments. By quantitation of signal intensities of phosphorylated proteins on 2D-gels, we observed 10 significant changes during glucose starvation, nitrosative, oxidative and osmotic stress conditions. Especially, the appearance of two newly phosphorylated isoforms of FdaB (fructose-bisphosphate aldolase) and HchA (molecular chaperone Hsp31/glyoxalase 3) may lead to a suggestion of new metabolic pathways such as a methylglyoxal detoxifying mechanism. Furthermore, due to the identification of the phosphorylation site T537 of Pyk (pyruvate kinase) it was possible to propose a fine tuning mechanism in dependency of the energy charge state of the cell. Of special interest was the identification of arginine phosphorylated peptides in B. subtilis. Consequently, the phosphopeptide enrichment protocol was optimized. In cooperation with A. Elsholz (Inst. f. Microbiology, EMAU Greifswald) it was possible to identify arginine phosphorylation sites in McsB (arginine kinase) and ClpC (ATPase). On the base of a global phosphatase mutante analysis (ΔywlE) 111 arginine phosphorylated peptides were identified via mass spectrometry using the optimized enrichment protocol. To enhance the quality of quantitation of phosphorylated proteins a protocol was developed in which the potential of the 2D-gel (protein/ -isoform separation), the identification of phosphorylated proteins via Pro-Q Diamond, and the quantitation via metabolic labeling were combined. In the result an improved reproducibility and a higher sensitivity compared to the gel-based approach were reached.

Download full text files

Export metadata

Additional Services

Share in Twitter Search Google Scholar
Metadaten
Author: Katrin Bäsell
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001463-5
Title Additional (English):Global phosphoproteome analysis of Gram-positive bacteria with particular regard to regulatory mechanisms
Advisor:Prof. Dr. Michael Hecker
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2013/04/23
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2013/03/27
Release Date:2013/04/23
Tag:2D-Gelelektrophorese, Phosphopeptid-Anreicherung, Phosphoproteom
GND Keyword:LC-MS, Phosphorylierung
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie