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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001308-7

Burkholderia pseudomallei in Northern Vietnam: environmental detection and molecular characterization of strains

  • The worldwide distribution and prevalence of melioidosis, an infectious disease caused by the soil-dwelling Gram-negative bacterium Burkholderia pseudomallei, is unknown. In Vietnam, sporadic cases of melioidosis have been reported for decades, but clinical and epidemiological data for the indigenous population are still scarce. In this study, we reviewed clinical and demographic data of patients with culture-proven melioidosis diagnosed at a single large referral hospital in Hanoi between November 1997 and December 2005. The clinical manifestations of melioidosis with fatal septicaemia as the most common presentation, a high rate of underlying diseases and a peak of cases admitted during the wet season were similar to studies from other endemic areas. The geographical origin of melioidosis patients shows that melioidosis exists in at least 18 northern provinces. The characterization of clinical B. pseudomallei strains by multilocus sequence typing identified 17 different sequence types (STs), ten of which have (as yet) not been found outside Vietnam. Several of these STs presumably were generated through recent evolutionary events in this rapidly diversifying bacterial species, and thus restricted geographic distribution may be a consequence of limited time passed since emergence. In order to define the distribution of the bacterium in the environment, our study also aimed to develop a more sensitive culture method for the detection of B. pseudomallei from soil samples in endemic areas compared to the currently used culture method based on soil dispersion in water. Our newly developed protocol involving soil dispersion in a polyethylene glycol and sodium deoxycholate solution increased the yield of viable B. pseudomallei from soil samples. Comparative testing of soil samples from Northeast Thailand covering a wide range of B. pseudomallei concentrations demonstrated a significantly higher recovery (p < 0.0001) of B. pseudomallei colony forming units by the new method compared to the conventional method. Our data indicate that using the detergents polyethylene glycol and sodium deoxycholate not only results in a higher recovery of viable B. pseudomallei, but also results in a shift in the bacterial species recovered from soil samples. Molecular methods based on direct bacterial nucleic acid extraction from environmental samples and subsequent amplification have the potential to overcome many restrictions of traditional microbiological approaches. Moreover, culture-dependent methods require special expertise in recognizing B. pseudomallei colony morphologies. Thus, a highly sensitive culture-independent DNA-based method that allows direct quantification of B. pseudomallei from soil is needed, particularly in diagnostic laboratories outside endemic areas. We therefore aimed to establish a protocol for B. pseudomallei soil DNA isolation, purification and quantification by qPCR targeting a type three secretion system 1 single copy gene. This assay was validated using 40 soil samples from Northeast Thailand that underwent parallel bacteriological culture. All 26 samples that were B. pseudomallei-positive by direct culture were B. pseudomallei qPCR-positive, with a median of 1.84 x 104 genome equivalents (range 3.65 x 102 to 7.85 x 105) per gram of soil. This was 10.6 fold (geometric mean; range 1.1 to 151.3) higher than the bacterial count as defined by culture. Moreover, the qPCR detected B. pseudomallei in seven samples (median 36.9 genome equivalents per g soil; range 9.4 to 47.3), which were negative on direct culture. These seven positives were reproduced using a nested PCR targeting a second, independent B. pseudomallei-specific sequence. Two samples were direct culture and qPCR negative but nested PCR positive. Five samples were negative by both PCR methods and culture. In conclusion, this is the first report on a series of cases describing clinical and epidemiological features of melioidosis and corresponding Burkholderia pseudomallei strains from northern Vietnam. Moreover, our newly developed culture-based and PCR-based methods provide highly specific and sensitive tools for the quantitative environmental surveillance of B. pseudomallei.
  • Melioidose ist eine Infektionskrankheit, verursacht vom Gram-negativen Bodenbakterium Burkholderia pseudomallei, deren weltweite Verteilung und Prävalenz unklar ist. Gelegentliche Fälle von Melioidose wurden über Dekaden in Vietnam beschrieben, allerdings sind klinische und epidemiologische Daten zur einheimischen Bevölkerung selten. In dieser Arbeit wurden klinische und demographische Daten von Patienten mit kulturell bestätigter Melioidose betrachtet. Alle Patienten wurden zwischen November 1997 and Dezember 2005 im Bachmai Hospital in Hanoi behandelt und deren Daten akquiriert. Die häufigste klinische Manifestation war die schwere Sepsis. Eine signifikant (p < 0,05) erhöhte Fallzahl konnte, wie in anderen Studien belegt, während der Regenzeit beobachtet werden. Die geographische Verteilung zeigte das Vorkommen von Melioidose in mindestens 18 nördlichen vietnamesischen Provinzen. Durch die Charakterisierung mittels „multilocus sequence typing“ (MLST) konnten die klinischen B. pseudomallei Isolate 17 verschieden Sequenztypen (ST) zugeordnet werden. Zehn dieser Sequenztypen wurden bis jetzt nicht außerhalb von Vietnam beschrieben. Etliche Sequenztypen entwickelten sich durch naheliegende evolutionäre Ereignisse, was die begrenzte geographische Ausbreitung kurz nach Auftreten von Melioidose erklärt. Um die Verteilung von B. pseudomallei in der Umwelt besser erfassen zu können, wurde eine sensitivere Kultur-Methodik für Nachweis und Quantifizierung aus Boden erarbeitet. Durch den Einsatz von Polyethylenglycol und Natrium-Deoxycholat anstatt Wasser wurde die Ablösung der Bakterien von Bodenpartikeln verbessert und eine erhöhte Anzahl vitaler B. pseudomallei nachgewiesen. Verglichen mit der konventionellen Methodik konnten in Bodenproben aus Nordost Thailand signifikant (p < 0,0001) höhere Koloniezahlen von B. pseudomallei über weite Konzentrationsbereiche nachgewiesen werden. Zudem war eine Verschiebung der isolierten bakteriellen Spezies zu beobachten. Einschränkungen traditioneller mikrobiologischer Verfahren können durch molekulare Methoden, die auf direkter Nukleinsäureextraktion mit anschließender Amplifikation derselben beruhen, umgangen werden. Zudem benötigen Kultur-abhängige Techniken spezielle Expertise um die unterschiedlichen Morphotypen von B. pseudomallei erkennen zu können. Daher werden sensitive, Kultur-unabhänge Methoden zum direkten Nachweis und zur Quantifizierung von benötigt. Ein solches Protokoll zur Isolierung von B. pseudomallei DNA aus Bodenproben und Quantifikation wurde erarbeitet. Die Bestimmung der B. pseudomallei Anzahl erfolgte per quantitativer real-time PCR (qPCR) anhand eines spezifischen Einzel-Kopie Genes des Typ 3 Sekretionssystems 1. Die Validierung und der Vergleich zu Kultur-abhängigen Verfahren erfolgte an 40 Umweltproben aus dem Nordosten Thailands. Alle 26 Kultur-positiven Proben zeigten sich auch qPCR-positiv. Mit einem Median von 1,84 x 104 Genom-Equivalenten (GE; Bereich 3,65 x 1 02 bis 7,85 x 105) pro Gram Boden wurden im Vergleich zur Kultur 10,6-fach (Geometrischer Mittelwert; 1,1 bis 151,3) höhere B. pseudomallei Zahlen nachgewiesen. Zusätzlich wurde B. pseudomallei in sieben Kultur-negativen Proben per qPCR nachgewiesen und quantifiziert (Median 36,9 GE / g Boden; 9,4 bis 47,3). Die Bestätigung dieser Ergebnisse erfolgte über den erfolgreichen Nachweis einer zweiten B. pseudomallei spezifischen, unabhängigen Sequenz durch eine nested PCR. Zwei Proben zeigten sich nur mit dieser nested PCR positiv. Fünf Proben waren mit allen angewendeten Proben B. pseudomallei negativ. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit erstmals klinische und epidemiologische Charakteristika von Melioidose und korrespondierenden B. pseudomallei-Isolaten bei einer Reihe von Erkrankten in Nord-Vietnam beschrieben. Zudem wurde eine neue, verbesserte Kultur-abhängige als auch Kultur-unabhängige Methodik zu Nachweis und Quantifizierung von B. pseudomallei erarbeitet. Diese bieten nun spezifische und sensitive Möglichkeiten zur quantitativen Betrachtung von B. pseudomallei in der Umwelt.

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Metadaten
Author: Thanh Trung TRINH
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001308-7
Title Additional (German):Burkholderia pseudomallei in Nord-Vietnam: Detektion in der Umwelt und molekulare Charakterisierung der Stämme
Advisor:Prof. Dr. Ivo Steinmetz
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2012/09/21
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2012/09/12
Release Date:2012/09/21
Tag:Burkholderia pseudomallei, Melioidosis, Vietnam, culture based method, qPCR
GND Keyword:Burkholderia pseudomallei, Melioidosis, Vietnam, culture based method, qPCR
Faculties:Universitätsmedizin / Friedrich-Loeffler-Institut für Medizinische Mikrobiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie