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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001407-6

Enzymatische Charakterisierung des Intermediär- und Fermentationsstoffwechsels von Staphylococcus aureus COL und Bacillus subtilis 168

  • Staphylococcus aureus (S. aureus) ist einer der meist gefürchtetsten pathogenen Mikroorganismen, der verantwortlich ist für eine Vielzahl von nosokomialen Infektionen und Krankheiten. S. aureus ist in der Lage, sich an verändernde Umweltbedingungen auf Ebene der Genexpression anzupassen, was zu unterschiedlichen Proteinzusammensetzungen und somit zu Veränderungen in der Metabolitenkomposition und metabolischen Aktivität führt. Außerdem stellt die Fähigkeit, Resistenzen gegen gegenwärtig genutzte Antibiotika zu entwickeln, eine Gefahr dar und macht diesen Keim in seiner Behandlung so schwierig. Für ein vollständiges Verstehen der Proteom-, Transkriptom- und Metabolomdaten ist die Untersuchung der Enzymaktivitäten ein entscheidendes Hilfsmittel. In der vorliegenden Arbeit wurden die enzymkatalytischen Eigenschaften sowie die spezifischen Enzymaktivitäten der Enzyme des Intermediär- und Fermentationsstoffwechsels untersucht. Aus Zellen der logarithmischen, transienten und stationären Wachstumsphase unter aeroben wie auch anaeroben Bedingungen wurden für die Enzyme das pH-Optimum, die maximale Reaktionsgeschwindigkeit (vmax) und die Substratkonzentration der halbmaximalen Reaktionsgeschwindigkeit (Km) bestimmt. In S. aureus COL wird die Glucose unter aeroben Bedingungen hauptsächlich über die Glycolyse metabolisiert. Glucose-6-phosphat wird weiter zu Pyruvat umgesetzt, welches wiederum durch die Pyruvat-Oxidase zu Acetylphosphat oder durch den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex zu Acetyl-CoA verstoffwechselt wird. Durch die Phosphatacetyl-Transferase wird das Acetyl-CoA im Folgenden ebenfalls zu Acetylphosphat umgesetzt und nicht dem Citrat-Zyklus zugeführt. Die Acetat-Kinase nutzt das Acetylphosphat zur Generierung von ATP. Geringe extrazelluläre Lactat-Konzentrationen weisen auf eine geringere Bedeutung der Lactat-Dehydrogenase unter aeroben Wachstumsbedingungen hin. Gleichwohl wird ein kleiner Teil des Pyruvates zur Regeneration von NAD+ durch die Lactat-Dehydrogenase genutzt. In der transienten und stationären Wachstumsphase werden die Gene der Enzyme für Gluconeogenese und Citrat-Zyklus vermehrt exprimiert. Lactat und Acetat werden als Kohlenstoff- und Energiequelle wieder aufgenommen und dienen der Bildung unterschiedlicher Intermediate, wie beispielsweise der Bildung von NADPH über Glucose-6-phosphat im Pentose-Phosphat-Weg. Lediglich die Citrat-Synthase, Isocitrat-Dehydrogenase und Fumarat-Hydratase des Citrat-Zyklus konnten enzymologisch untersucht werden, was auf eine geringe metabolische Aktivität im Citrat-Zyklus hinweist. Möglicherweise dient der erste Teil des Citrat-Zyklus nur der Einführung von Aminosäuren als Kohlen- und Stickstoffquelle in den Metabolismus. Unter anaeroben Bedingungen wird die Glucose in der Glycolyse und der gemischten Säuregärung zu Lactat und Ethanol umgesetzt. Hohe spezifische Enzymaktivitäten der Lactat- und Alkohol-Dehydrogenase konnten nachgewiesen werden. Die Energie in Form von ATP wird auch in dieser Phase des Wachstums durch Substratkettenphosphorylierung generiert. Bacillus subtilis 168 (B. subtilis 168) ist ein grampositives apathogenes Bakterium, das durch die Zugabe von Pyruvat auch zum Wachstum unter sauerstofffreien Bedingungen befähigt ist. Es exprimiert Enzyme der 2,3-Butandiol- und Lactatfermentation. In der hier vorliegenden Arbeit wurden die enzymkatalytischen Eigenschaften von Enzymen des Intermediär- und Fermentationsstoffwechsels untersucht. In der logarithmischen Wachstumsphase wird die Glucose über die Glycolyse verstoffwechselt. Wie bei S. aureus COL ist der Eintritt des Glucose-6-phosphates in den Pentose-Phosphat-Weg aufgrund einer höheren spezifischen Enzymaktivität der Glucose-6-phosphat-Isomerase limitiert. Die Energie in Form von ATP wird auch hier hauptsächlich über Substratkettenphosphorylierungsreaktionen generiert. Die Bedeutung der Lactat-Dehydrogenase-Aktivität unter aeroben Bedingungen ist noch nicht eindeutig geklärt, jedoch kann davon ausgegangen werden, dass auch hier ein Teil des Pyruvates zur Regeneration von NAD+ durch die Lactat-Dehydrogenase umgesetzt wird. Unter anaeroben Bedingungen wurden hohe Lactat-Dehydrogenasen-Aktivitäten gemessen. Außerdem wird die Glucose zur Regeneration von NAD+ zu D-2,3-Butandiol fermentiert. Zusammenfassend ist zu sagen, dass enzymologische Untersuchungen und die Erforschung der spezifischen Enzymaktivitäten unter bestimmten Bedingungen ein gutes Hilfsmittel für metabolische Studien ist und diese gut mit vorhandenen Proteom- und Metabolomdaten verglichen werden können. Enzymanalysen sind nicht einfach handhabbar, bieten aber die Möglichkeit, einen Blick in die Physiologie von Mikroorganismen zu werfen. Für ein allumfassendes Verständnis ist es wichtig, Enzymaktivitäten zu untersuchen.
  • Staphylococcus aureus (S. aureus) is one of the most feared pathogens, responsible for a variety of nosocomial infections and a range of diseases. S. aureus is able to respond to changes in environmental conditions with adaptation on gene expression level resulting in different protein patterns and therefore changes in metabolite composition and metabolic activity. Furthermore the ability to develop resistances against present antibiotics makes S. aureus dangerous and difficult to handle for man. For a complete understanding of proteome, transcriptome and metabolome, the investigation of enzyme activities is a crucial step. In the presented study catalytic properties and specific enzyme activities from enzymes of the intermediary and fermentative metabolism were investigated. In cells growing exponentially, transiently, stationary or under anaerobic conditions the enzymes pH optima, maximum speed of activity (vmax) and the substrate concentration to produce 50 % of vmax (Km) were determined. In S. aureus COL the glucose mainly metabolised via glycolysis under aerobic conditions. Glucose 6-phosphate metabolizes to pyruvate, which either will be converted to acetylphosphate by the pyruvate oxidase or to acetyl-CoA by the pyruvate dehydrogenase complex. Acetyl-CoA is turned into acetylphosphate by the phosphate acetyltransferase, whereas the transformation of acetyl-CoA in the citric acid cycle is not probable. By the acetate kinase, acetylphosphate will be used to generate ATP. Low extracellular lactate concentration implicates that the lactate dehydrogenases are less important during aerobic growth. To some extend, pyruvate is metabolized to lactate to recycle NAD. In the transient and stationary growth stage, enzymes of the glucogenesis and the citric acid cycle are upregulated. Lactate and acetate are reused as carbon and energy source to generate glucose 6-phosphate for NADPH formation via pentose phosphate pathway. Except for the citrate synthase, the isocitrate dehydrogenase and the fumarate hydratase activities of the citric acid cycle enzymes were not detectable, indicating the minor importance of this pathway. Under anaerobic conditions the glucose is mainly metabolized to lactate or ethanol via glycolysis and mixed acid fermentation. High specific enzyme activities of the lactate dehydrogenase and the alcohol dehydrogenase were verified, whereas enzyme activities of the pyruvate formate lyase and the 2,3-butanediol fermentation were not detectable. If the citric acid cycle is downregulated, energy will be generated by substrate chain phosphorylation. Bacillus subtilis 168 (B. subtilis 168) is a grampositive apathogene bacterium, which is able to grow under anaerobic conditions upon addition of pyruvate. It expresses enzymes for 2,3-butanediol and lactate fermention. In the presented study catalytic properties of many enzymes of the intermediary and fermentative metabolism were investigated by enzyme kinetic studies. During exponential growth glucose is metabolized via glycolysis. Similar to S. aureus COL the specific enzyme activity of the glucose 6-phosphate isomerase is higher than the activity of the glucose 6-phosphate dehydrogenase, indicating, that the metabolisation via the pentose phosphate pathway is limited. Energy is formed by substrate chain phosphorylation. Phosphate acetyltransferase and acetate kinase activity were measured showing that the energy will be generate by this two enzymes, similar to S. aureus COL. Therefore it is possible that acetate is excreted as overflow metabolite. The importance of the lactate dehydrogenase under this condition is not clear yet. It can be assumed that a little part of pyruvate will be used for NAD+ recycling. Under anaerobic conditions a high activity of lactate dehydrogenase was detected. Furthermore glucose can be formed to 2,3-butanediol for regeneration of NAD. To sum up the investigation of enzyme kinetic parameters and specific enzyme activities are good tools for metabolic studies, to compare them to proteome and metabolome analysis. Enzyme analysis are not that easy in handling but they are a good choice to look into the physiology of microorganism. For an overall understanding it is a need to determine enzyme activities.

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Metadaten
Author: Kristin Krause
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001407-6
Title Additional (English):Enzymatic characterisation of the intermediary and fermentative metabolism of Staphylococcus aureus COL and Bacillus subtilis 168
Advisor:Prof. Dr. Rüdiger Bode
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2013/02/07
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2012/12/20
Release Date:2013/02/07
Tag:Bacillus subtilis, Enzym, Fermentation, Intermediärstoffwechsel, Staphylococcus aureus
enzyme, fermentation, glucokinase, glycolysis, metabolism
GND Keyword:Bacillus subtilis, Enzym, Enzymkinetik, Fermentation, Glykolyse, Intermediärstoffwechsel, MRSA, Metabolismus, Staphylococcus aureus, TCC
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Mikrobiologie - Abteilung für Genetik & Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie