• search hit 2 of 3
Back to Result List

Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001324-8

Proceedings in the thiolome of low GC, Gram-positive bacteria

  • Thiol or sulfhydryl groups are highly reactive functional groups in cellular systems. Molecules carrying thiol groups are mostly derivatives of the amino acid cysteine and are grouped as low molecular weight (LMW)-thiols: coenzyme A (CoA), glutathione (GSH) or bacillithiol (BSH). LMW-thiols can help in the maintenance of the reduced cellular environment as so called redox-buffers. Additionally, they act as co-factors in enzyme reactions or help in the detoxification of reactive oxygen or nitrogen species, electrophilic compounds or thiophilic metalloids (arsenite, tellurite). In proteins from different organisms cysteine is underrepresented compared to other amino acids, but still overtakes diverse roles. It is an important determinant in the tertiary and quaternary structure of proteins. The nucleophilic character of the thiol or thiolate group, respectively, makes cysteine the catalytically active amino acids of different enzymes. As a precursor cysteine participates in the formation of Fe-S clusters and coordinates different co-factors like heme, iron or zinc. The main goal of this study was the investigation of the different cellular thiol pools, now defined as the thiolome. The thiolome is the entity of the cellular thiol pools, i.e. LMW-thiols and protein thiols, and the dynamics between these pools. In Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus mixed disulfides between protein thiols and free LMW-thiols, so called S-thiolations, were identified in different proteins in response to the thiol specific reagent diamide. Some of these S-thiolations were located at catalytically active cysteine residues. Subsequent analysis of metabolites supports this: the S-thiolation of the cobalamine-independent methionine-synthase MetE led to a decrease of the cellular methionine content. Additionally, the conversion of threonine to different branched-chain amino acids (BCAAs) was disrupted by the S-thiolation of the branched-chain amino acid aminotransferase YwaA, thereby probably inducing the synthesis of ppGpp, the alarmon of the stringent response. In addition to the identification of S-thiolations a technique was established which allowed the discrimination between intra- and intermolecular disulfides. The non-reducing/ reducing diagonal gel electrophoresis was applied to B. subtilis and S. aureus and confirmed known existing disulfide bonds, e.g. in alkyl hydroperoxide reductase AhpC or the thiol peroxidase Tpx. In response to diamide an increase of specific disulfide bonds in different proteins was observed. The analysis of the LMW-thiol content by an HPLC-approach allowed the observation of the dynamics of the thiolome. In response to diamide the reduced LMW-thiol content decreased by 75%, reduced protein thiols by 60%. Collaborations with other working groups allowed the identification of BSH in this approach. Additionally, an unknown thiol was found that is likely a derivative of BSH. Screening of the LMW-thiol content of different S. aureus-strains under various growth conditions revealed that strains 8325-4 and SH1000 lack BSH. The lack of BSH was attributed to an 8 bp-duplication in the bshC-gene that encodes the last enzyme of the BSH-synthesis. BSH-production was restored by transducing plasmid-borne functional BshC from strain Newman into strains 8325-4 and SH1000. The reconstitution of the BSH-synthesis aided in the resistance to the antibiotic fosfomycin but did not increase the resistance to different oxidants (diamide, sodium hypochlorite, hydrogen peroxide). The production of BSH had also positive effects on the survival of S. aureus inside human bronchial epithelial cells and murine macrophages in phagocytosis assays. Additionally, a GSH-uptake was observed into S. aureus which has before been known as a GSH-free bacterium. Taken together, this thesis provides the first insights into both, the LMW-thiol- and protein thiol pool of low GC, Gram-positive bacteria under different conditions. A plethora of different methodologies was used to describe the thiolome. The bacterial thiolome is a sophisticated system which is tightly regulated, but also flexible enough to not rely on determined molecules like BSH. The influences of the thiolome are not restricted to its own system and regulation, but also affect different branches of cellular physiology like the metabolism of BCAAs.
  • Thiol- oder Sulhydrylgruppen sind hoch reaktive funktionelle Gruppen in zellulären Systemen. Moleküle, die eine Thiolgruppe aufweisen, sind meist Derivate der Aminosäure Cystein und werden zu der Gruppe der niedermolekularen Thiole (low molecular weight thiols; LMW-thiols) zusammengefasst: Coenzym A (CoA), Glutathion (GSH) oder Bacillithiol (BSH). LMW-Thiole helfen bei der Aufrechterhaltung des reduzierenden Zellmilieus als sogenannte Redox-Puffer. Zusätzlich agieren sie als Co-Faktoren in Enzymen, detoxifizieren reaktive Sauerstoff- oder Stickstoffverbindungen, elektrophile Substanzen, Antibiotika oder thiophile Metalloide (Arsenit, Tellurit). In Proteinen verschiedener Organismen kommt Cystein im Vergleich zu anderen Aminosäuren am seltensten vor, übernimmt aber trotzdem diverse Rollen. Es trägt zur Ausprägung und Stabilisierung der Tertiär- und Quartärstruktur von Proteinen bei. Der nukleophile Charakter der Thiol- bzw. Thiolatgruppe macht Cystein zur katalytisch aktiven Aminosäure in Enzymen. Cystein dient als Vorstufe in der Formation von Fe-S Clustern, koordiniert aber auch verschiedene Co-Faktoren, wie Häm, Eisen oder Zink in Proteinen. Das Hauptziel dieser Arbeit war die Untersuchung der verschiedenen zellulären Thiolpools, hier definiert als Thiolom. Das Thiolom ist die Gesamtheit der zellulären Thiolpools, d.h. der LMW- und Proteinthiole, sowie die Dynamik zwischen beiden Pools. In verschiedenen zytoplasmatischen Proteinen von Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus wurden gemischte Disulfide zwischen Protein- und LMW-Thiolen (S-Thiolierungen) nach Gabe des thiol-spezifischen Reagenz Diamid identifiziert. Einige dieser S-Thiolierungen waren an katalytisch aktiven Cysteinen lokalisiert. Eine darauffolgende Analyse von Metaboliten unterstützt dies: eine S-Thiolierung der Cobalamin-unabhängigen Methionin-Synthase MetE führte zu einem reduzierten zellulären Methioningehalt. Auf Grund einer S-Thiolierung der Aminotransferase YwaA brach der Umbau von Threonin zu verzweigt-kettigen Aminosäuren zusammen, wodurch vermutlich das Alarmon der „stringent response“ ppGpp synthetisiert wurde. Zusätzlich zu der Identifikation von S-Thiolierungen wurde eine Technik eingeführt, die die Unterscheidung zwischen intra- und intermolekularen Disulfidbrücken erlaubte. Die nicht-reduzierende/ reduzierende Diagonale Gelelektrophorese wurde bei B. subtilis und S. aureus angewandt und bestätigte die Existenz bekannter Disulfidbrücken, z.B. bei der Alkylhydroperoxidreduktase AhpC und der Thiolperoxidase Tpx. Durch Gabe von Diamid konnte die Bildung spezifischer Disulfidbrücken in bestimmten Proteinen beobachtet werden. Die Analyse des LMW-Thiolgehalts mittels eines HPLC-Ansatzes zeigte die Dynamik des Thioloms. Während des Diamidstresses verringerte sich der reduzierte LMW-Thiolgehalt um 75%, der reduzierte Proteinthiolgehalt um 60%. In Kooperation mit anderen Arbeitsgruppen konnte BSH nachgewiesen werden. Desweiteren ergaben sich Hinweise auf ein unbekanntes Thiol – wahrscheinlich ein Derivat von BSH. Bei der Analyse des LMW-Thiolgehalts in verschiedenen S. aureus-Stämmen unter unterschiedlichen Wachstumsbedingungen zeigte sich, dass die Stämme 8325-4 und SH1000 kein BSH bilden. Das Fehlen von BSH war auf eine 8 bp-Duplikation im bshC-Gen zurückzuführen, dessen Produkt den letzten Schritt der BSH-Synthese katalysiert. Die BSH-Synthese konnte in den Stämmen 8325-4 und SH1000 durch Transduktion eines Plasmid-kodierten funktionellen bshC-Gens von Stamm Newman wieder hergestellt werden. Die Rekonstruktion der BSH-Synthese führte zu einer gesteigerten Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Phosphomycin, aber nicht gegenüber unterschiedlichen Oxidantien (Diamid, Natriumhypochlorit, Wasserstoffperoxid). Die Produktion von BSH hatte positive Effekte auf das Überleben von S aureus in menschlichen Bronchialepithelzellen oder murinen Makrophagen in Phagocytose-Assays. Zusätzlich konnte eine Aufnahme von GSH in S. aureus nachgewiesen werden, welches zuvor als GSH-freies Bakterium bekannt war. Zusammengefasst bietet diese Dissertation zum ersten Mal kombinierte Einblicke in beide Thiolpoole - LMW- und Proteinthiole - von Gram-positiven Bakterien mit niedrigem GC-Gehalt, welche unter verschiedenen Bedingungen analysiert wurden. Eine Vielfalt an Methoden wurde zur Beschreibung des gesamten Thioloms eingesetzt. Das bakterielle Thiolom ist ein filigranes System, welches streng reguliert ist, aber flexibel genug um nicht auf einzelne Moleküle, wie BSH, angewiesen zu sein. Der Einfluss des Thioloms erstreckt sich nicht nur auf sein eigenes System und dessen Regulation, sondern beeinflusst verschiedene Bereiche der zellulären Physiologie, wie den Stoffwechsel verzweigtkettiger Aminosäuren.

Download full text files

Export metadata

Additional Services

Share in Twitter Search Google Scholar
Metadaten
Author: Dierk-Christoph Pöther
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001324-8
Title Additional (German):Fortschritte im Thiolom Gram positiver Bakterien mit niedrigem GC-Gehalt
Advisor:Prof. Dr. Michael Hecker
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2012/11/01
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2012/08/02
Release Date:2012/11/01
GND Keyword:Bacillus, Glutathion, Metabolom, Proteom, Staphylococcus aureus
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie