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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001415-2

Das Metagenom als Quelle neuer oxidativer Enzyme für die Biotechnologie

  • Der Einsatz von Enzymen ist inzwischen für viele Bereiche der chemischen und pharmazeutischen Industrie beschrieben. Dabei ermöglichen die Enzyme als Biokatalysatoren in vielen Fällen Syntheserouten, die umweltverträglichere Wege zum gewünschten Produkt darstellen als die vergleichbaren etablierten chemischen Routen. Insbesondere ihre oft stereo-, regio- und chemoselektiven Umsätze eröffnen Zugang zu wichtigen pharmazeutisch relevanten Produkten und Zwischenprodukten. Nach wie vor gibt es aber in vielen Enzymklassen Bedarf nach neuen oder verbesserten Enzymen. Insbesondere bei den oxidativen Enzymen erfüllen die zur Zeit vorhandenen Biokatalysatoren oftmals nicht die Anforderungen hinsichtlich Aktivität, Stabilität oder Selektivität. Das Auffinden neuer Biokatalysatoren, die eine Transformation von chemokatalysierten zu enzymatischen Prozessen ermöglichen, stellt die Motivation für die vorliegende Arbeit dar. Um Zugang zu neuen Enzymen zu erlangen, bestehen die klassischen Wege in einer Anreicherungskultur aus einer Umweltprobe und der nachfolgenden Isolierung von Organismen mit der gewünschten Enzymaktivität, oder in der Suche in einer bereits angelegten Stammsammlung. Die meisten Mikroorganismen können jedoch unter Laborbedingungen nicht kultiviert werden. Der Metagenom-Ansatz öffnet den Zugang zu eben diesen Enzymen. Dazu wird der Kultivierungsschritt umgangen und die DNA der Umweltprobe direkt isoliert. Diese metagenomische DNA kann anschließend entweder über ein Aktivitäts-basiertes oder über ein Sequenz-basiertes Screening auf bestimmte Enzyme hin untersucht werden. In der vorliegenden Arbeit wurde der Aktivitäts-basierte Ansatz gewählt, da auf diese Weise völlig neue Enzyme gefunden werden können, die keine Homologie zu bereits beschriebenen aufweisen. Als Grundlage für das Screening wurden metagenomische Bibliotheken aus verschiedenen Umweltproben angelegt. Um die Zahl der zu durchmusternden Klone gering zu halten, wurde ein Großteil der DNA in Cosmide kloniert. Als mikrobieller Wirt für die rekombinante Expression der Proteine wurde Escherichia coli gewählt. Der Prozess des Screenings stellte den wesentlichen Teil der Arbeit dar. Dazu wurden verschiedene Enzymassays adaptiert, um die enzymatisch gebildeten Produkte zu detektieren. In vielen Fällen wurde dies durch die Bildung farbiger Produkte ermöglicht, die spektrophotometrisch detektiert werden konnten. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag dabei auf den oxidativen Enzymen, insbesondere den Monooxygenasen. Verschiedene Gruppen von Monooxygenasen wurden dabei betrachtet: Styrol-Monooxygenasen, P450-Monooxygenasen sowie Baeyer-Villiger-Monooxygenasen. Außerdem wurden die metagenomischen Bibliotheken auf Oxidasen durchmustert. Neben oxidativen Enzymen wurde nach Transaminasen, Esterasen, Proteasen und Phosphatasen gescreent. Zwei metagenomische Esterasen und drei Phosphatasen konnten auf diese Weise gefunden werden. In einem weiteren Teil der Arbeit wurden die unterschiedlichen Wege, über den Aktivitäts-basierten Metagenom-Ansatz zu neuen oxidativen Enzymen zu gelangen, ausführlich diskutiert. Der Fokus lag dabei auf der Wahl der Biotope für das Anlegen der metagenomischen Bibiotheken, den DNA-Isolierungsmethoden sowie der Nachweisempfindlichkeit und Hochdurchsatz-Fähigkeit der verwendeten Assays. Des Weiteren wurde der Zusammenhang zwischen der erwarteten Größe der Gene und der durchmusterten Bibliothek diskutiert. Dabei wurde die Schlussfolgerung gezogen, dass der Metagenom-Ansatz grundsätzlich ein großes Potential zur Identifizierung neuer Enzyme für die Biotechnologie birgt, aber Grenzen beim Auffinden großer, komplexer oder seltener Enzyme aufweist.
  • The application of enzymes is described in many fields of chemical and pharmaceutical industry. Enzymes enable synthesis routes which are often less environmentally harmfull than established chemical routes. Especially their stereo-, regio- and chemoselective reactions provide in many cases access to pharmaceutically relevant products and intermediates. Still, for some enzyme classes there is nevertheless need for new or improved enzymes. In particular for oxidative enzymes, the currently available enzymes often do not meet the desires. The discovery of novel biocatalysts, which enable the transformation of chemically to enzymatically catalysed processes, was the main motivation of this thesis. One traditional way to gain access to novel enzymes is the enrichment cultivation of an environmental sample and subsequent isolation of organisms with the desired enzymatic activities. An alternative is the screening of already existing strain collections. Still, most microorganisms cannot be cultivated in the laboratory. The metagenomic approach provides access to these organisms and their biocatalysts by circumvention of the cultivation step and direct isolation of the DNA of an environmental sample. This metagenomic DNA can be screened for the presence of enzymes either in an activity-based or a sequence-based way. In this thesis, the activity-based approach was chosen because in this way completely new enzymes can be found which are not homologous to already described enzymes. As a basis for the screening, metagenomic libraries were created from various environmental samples. To keep the number of clones that need to be screened low, most of the DNA was cloned into cosmids. Escherichia coli was chosen as microbial host for the expression of the proteins. The process of screening was the main part of the thesis. For this purpose, different enzyme assays were adopted to detect the enzymatically formed products. In many cases this was achieved by formation of a colored product which could be detected spectrophotometrically. The main focus was on oxidative enzymes, especially on monooxygenases. Different types of monooxygenases were studied: Styrene monooxygenases, P450 monooxygenases and Baeyer-Villiger monooxygenases. Furthermore, the metagenomic libraries were screened for oxidases. Besides oxidative enzymes, the presence of transaminases, esterases, proteases and phosphatases was studied. Two metagenomic esterases and three phosphatases could be found in this way. The experimental results were discussed focussing on the choice of habitats for the construction of the metagenomic libraries, the extraction methods for the metagenomic DNA, as well as the efficiency of the enzymatic assays. Moreover, the correlation between the expected size of the desired enzymes and the screened library size was discussed. The conclusion was drawn that the metagenomic approach is a useful tool for the discovery of novel enzymes but shows limitations if large, complex or rare enzymes are the target of the screening.

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Metadaten
Author: Anke Hummel
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001415-2
Title Additional (English):The metagenome as source of novel oxidative enzymes for biotechnology
Advisor:Prof. Dr. Uwe Bornscheuer
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2013/02/19
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2012/08/28
Release Date:2013/02/19
GND Keyword:Biotechnologie; Biokatalyse; Metagenom; Enzym
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie