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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001809-1

Development of an enzyme-based method for production of food with low purine content

  • Gout was described by Hippocrates in the 5th century BC as a disease of rich people and linked with excess food and alcohol. It is caused by long-lasting hyperuricemia, which is a result of an imbalance between excretion and production of uric acid. The surplus of uric acid leads to deposition of monosodium urate crystals in the joints, which can initiate a painful inflammation called a gout attack. Despite various pharmacological treatments for this disease, a low purine diet remains the basis of all gout therapies. Since food is rich in purines, the aim of this project was to develop a novel enzyme system to decrease the purine content of food, what should result in reduced serum urate concentration in patients with hyperuricemia. The system consists of five degrading enzymes (adenine deaminase, guanine deaminase, xanthine oxidoreductase, urate oxidase and purine nucleoside phosphorylase) that combined in one product are able to hydrolyse all purines to a highly soluble allantoin, which can be easily removed from the body. This approach provides the patients a possibility to reduce the symptoms and frequency of gout attacks or even doses of prescribed drugs. In order to obtain necessary system components, yeast Arxula adeninivorans LS3 was screened for enzyme activities. A. adeninivorans is known to utilise various purines and this ability is a result of activity of desired enzymes, two of which, adenine deaminase and xanthine oxidoreductase, are in focus of this thesis. The analysis of growth of A. adeninivorans on various carbon and nitrogen sources gave the first insight into the cells’ nutrient preferences indicating the presence of purine degrading enzymes, such as adenine deaminase and xanthine oxidoreductase. Purines, such as adenine and hypoxanthine, could be utilised by this yeast as sole carbon and nitrogen sources and were shown to trigger the gene expression of the purine degradation pathway. Enzyme activity tests and quantitative real-time PCR method allowed for identification of the best inducers for adenine deaminase and xanthine oxidoreductase, as well as their concentration and time of induction. The adenine deaminase (AADA) and the xanthine oxidoreductase (AXOR) genes were isolated and subjected to homologous expression in A. adeninivorans cells using Xplor®2 transformation/expression platform. The selected transgenic strains accumulated the recombinant adenine deaminase in very high concentrations. The expression of AXOR gene posed difficulties and remained a challenge. Additional expression of both proteins in alternative E. coli system was undertaken but failed for AXOR gene. The recombinant adenine deaminase and wild-type xanthine oxidoreductase were purified and characterized biochemically. The characterization included determination of optimal pH and temperature, stability in different buffers and temperatures, molecular weight, substrate spectrum, enzyme activators and inhibitors, kinetics and intracellular localisation. The determination of these parameters was necessary to ensure optimal conditions for application of these enzymes in the industry. At the final stage, the enzymes were combined in one mix with provided guanine deaminase and urate oxidase and used to degrade purines in selected food constituents. The application was successful and demonstrated the potential of this approach for the production of food with lower purine concentration.
  • Gicht wurde von Hippokrates im 5. Jahrhundert v. Chr. als eine Krankheit der reichen Leute in Verbindung mit übermäßigem Alkohol- und Lebensmittelgenuss beschrieben. Sie wird durch lang anhaltende Hyperurikämie verursacht, die eine Folge eines Ungleichgewichts zwischen Ausscheidung und Produktion von Harnsäure ist. Der Überschuss von Harnsäure führt zur Ablagerung von Mononatriumuratkristallen in den Gelenken, die eine schmerzhafte Entzündung, genannt Gichtanfall, auslösen. Trotz verschiedener pharmakologischer Behandlungen für diese Erkrankung bleibt eine purinarme Ernährung die Grundlage aller Gicht-Therapien. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines Enzymmixes, mit dem sich der Puringehalt in Lebensmitteln reduzieren ließe, was bei deren Verzehr zu verringerten Serumharnsäure-Konzentrationen führen sollte. Der Mix umfasst fünf Enzyme (Adenin-Deaminase, Guanin-Deaminase, Xanthin-Oxidoreduktase, Uratoxidase und Purin-Nukleosid-Phosphorylase), welche kombiniert Purine in das gut lösliche Allantoin hydrolysieren können, das im Gegensatz zur Harnsäure vom Körper leichter ausgeschieden werden kann. Damit lassen sich bei Hyperurikämie-Patienten Gicht-Attacken abschwächen bzw. verhindern und die Dosis der zu deren Bekämpfung notwendigen Medikamente reduzieren. Um die für den Mix notwendigen Enzyme zu erhalten, wurde die Adenin-verwertende Hefe Arxula adeninivorans LS3 auf enzymatische Aktivitäten hinsichtlich des Purinabbaus untersucht. A. adeninivorans ist in der Lage verschiedene Purine zu verstoffwechseln, die u.a. durch Mitwirkung der Enzyme Adenin-Deaminase und Xanthin-Oxidoreduktase hydrolysiert werden können, welche im Mittelpunkt dieser Arbeit stehen. Wachstumsanalysen von A. adeninivorans-Zellen, kultiviert auf verschiedenen Kohlenstoff- und Stickstoff-Quellen, gaben eine erste Übersicht bezüglich der Purinverwertung, die das Vorhandensein von Purin-abbauenden Enzymen, wie der Adenin-Deaminase und der Xanthin-Oxidoreduktase, belegten. So nutzte diese Hefe Adenin und Hypoxanthin als C- und N-Quellen und es kam bei ihrer Zugaben zur Induktion des Purinabbauweges. Mit Hilfe von Enzymaktivitätstests sowie quantitativer real-time PCR ließen sich sowohl der Zeitpunkt der maximalen Adenin-Deaminase- und Xanthin-Oxidoreduktase-Akkumulation als auch der entsprechenden maximalen Transkriptakkumulation ermitteln. Die Adenin-Deaminase (AADA)- und Xanthin-Oxidoreduktase (AXOR)-Gene wurden isoliert und mit Hilfe der Xplor®2-Transformations/Expressionsplattform in A. adeninivorans exprimiert. Hierbei ließen sich transgene Hefestämme selektieren, die rekombinante Adenin-Deaminase in sehr hohen Konzentrationen akkumulierten. Im Gegensatz dazu stieß die Expression des AXOR-Gens auf Schwierigkeiten. Auch bei Nutzung alternativer Expressionssysteme (z.B. E. coli) war deren Expression nicht möglich. Sowohl die rekombinante Adenin-Deaminase als auch die in A. adeninivorans LS3 (Wildtyp) akkumulierte Xanthin-Oxidoreduktase wurden gereinigt und biochemisch charakterisiert. Die Charakterisierung umfasste die Ermittlung der pH- und Temperatur-Optima bzw. deren Stabilität in Abhängigkeit von Puffer und Temperatur. Zusätzlich wurden von beiden Enzymen das Molekulargewicht, das Substratspektrum, die intrazelluläre Lokalisation, deren Cofaktoren, Inhibitoren und kinetische Parameter bestimmt. Die Ermittlung aller dieser Parameter war notwendig, um eine optimale Wirkung der Enzyme beim Abbau von Purinen in Lebensmitteln zu gewährleisten. Abschließend wurden die gereinigten Enzyme Adenin-Deaminase und Xanthin-Oxidoreduktase im Gemisch mit der zur Verfügung gestellten Guanin-Deaminase sowie Uratoxidase auf Eignung für den Purinabbau in ausgewählten Nahrungsmitteln überprüft. Die dabei erhaltenen Ergebnisse belegen das Potenzial dieses Enzymmixes für die Herstellung von purinarmen Lebensmitteln.

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Metadaten
Author: Dagmara Jankowska
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001809-1
Title Additional (German):Entwicklung eines enzymatischen Verfahrens zur Herstellung purinarmer Lebensmittel
Advisor:Prof. Dr. Rüdiger Bode, Prof. Dr. Gotthard Kunze
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2014/04/30
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2014/04/14
Release Date:2014/04/30
Tag:Adenin-Deaminase, Purinabbau, Xanthin Oxidoreduktase, Xplor®2 Transformations-/Expressionssystem
Xplor®2 transformation/expression system, adenine deaminase, purine degradation, xanthine oxidoreductase
GND Keyword:Arxula adeninivorans, Biochemische Analyse, Enzym, Harnsäure, Lebensmittel, Purinderivate
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Mikrobiologie - Abteilung für Genetik & Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie