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Die Bedeutung der oberflächenlokalisierten Thioredoxinähnlichen Lipoproteine Etrx1 und Etrx2 für die extrazelluläre oxidative Stressresistenz und Pathogenität von Streptococcus pneumoniae

  • Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) sind Gram-positive und Katalase-negative humanspezifische Kommensalen der oberen und unteren Atemwege. Diese Bakterien sind andererseits auch als schwere Krankheitserreger bekannt und verursachen bei verschiedenen Bevölkerungsgruppen, wie beispielsweise Kindern, Älteren und immungeschwächten Personen sowohl Atemwegs- als auch lebensbedrohliche invasive Erkrankungen wie eine ambulant erworbene Pneumonie, Meningitis und Sepsis. Pneumokokken haben aufgrund ihrer Besiedelung des Respirationstraktes effiziente Mechanismen entwickelt, um in einer sauerstoffreichen Nische überleben zu können. Dabei richten sich die Mechanismen vor allem gegen reaktive Sauerstoffspezies (Reactive Oxygen Spezies, ROS), die einerseits als Abwehrfunktion des Wirts (oxidative burst) vom angeborenen Immunsystem und andererseits von den Pneumokokken selbst produziert werden, um als chemische Waffe zur Bekämpfung bakterieller Konkurrenten in ihrem Habitat eingesetzt zu werden. In der vorliegenden Arbeit wurde ein hochkonserviertes Zwei-Operon-System, das für die extrazelluläre oxidative Stress-Resistenz in S. pneumoniae verantwortlich ist, identifiziert und auf pathophysiologischer sowie struktureller Ebene charakterisiert. Dieses komplexe System besteht aus zwei integralen Cytochrom C-ähnlichen Membranproteinen (CcdA1 und CcdA2), zwei Thioredoxin-ähnlichen Lipoproteinen (Etrx1 und Etrx2) und einer Methioninsulfoxid-Reduktase AB2 (MsrAB2). Die Etrx-Proteine werden zwar in zwei räumlich voneinander getrennten Operonen kodiert, sind aber funktionell miteinander verbunden. Der Einfluss des Systems auf die Pathogenese der Pneumokokken wurde in Maus-Virulenz-Studien und Untersuchungen der Phagozytose unter Verwendung von isogenen Mutanten gezeigt. Sowohl in den in vivo als auch den in vitro Experimenten konnte gezeigt werden, dass der Verlust der Funktion beider Etrx-Proteine beziehungsweise der Methioninsulfoxid-Reduktase MsrAB2 die Virulenz der Pneumokokken stark reduziert. Hieraus resultierte eine erheblich verringerte Letalität des Wirts, eine beschleunigte bakterielle Aufnahme durch die Makrophagen sowie ein schnelleres Abtöten der Pneumokokken durch eine oxidative Schädigung von Oberflächen-lokalisierten Proteinen mittels Wasserstoffperoxid. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Etrx2 die Abwesenheit von Etrx1 und umgekehrt Etrx1 das Defizit von Etrx2 kompensieren kann. Durch Strukturaufklärung der beiden Thioredoxin-ähnlichen Proteine Etrx1 und Etrx2 sowie der Modellierung der beteiligten Komponenten CcdA und MsrAB2 konnte die Rolle jedes einzelnen Proteins dieses Systems (CcdA-Etrx-MsrAB2-System) bei der Reparatur beschädigter Oberflächen-lokalisierter Proteine in einem Modell dargestellt werden. Das postulierte Modell konnte über in vivo und in vitro Untersuchungen des Elektronentransfers innerhalb dieses Systems bestätigt werden. Mit der Bestimmung der Standardredoxpotentiale der rekombinanten Proteine Etrx1, Etrx2 und der Einzeldomänen MsrA2 und MsrB2 konnte in vitro gezeigt werden, dass der Elektronenfluss in Richtung von Etrx1 und Etrx2 zu MsrAB2 erfolgen muss. Die direkte Elektronenübertragung zwischen diesen Proteinen konnte in kinetischen Experimenten gezeigt werden. Die Messungen ergaben, dass Etrx1 bevorzugt mit der MsrA2-Untereinheit interagiert beziehungsweise Etrx2 sowohl mit der MsrA2-Untereinheit als auch mit der MsrB2-Untereinheit in Wechselwirkung treten kann. Der in vivo Redoxzustand von MsrAB2 wurde unter Verwendung der nicht-reduzierenden/reduzierenden „2D-Diagonal“-SDS-PAGE in den isogenen ccdA- und etrx-Mutanten bestimmt. Hierbei konnte ein Unterschied im Redoxzustand von MsrAB2 in den isogenen Einzelmutanten und Doppelmutanten von ccdA und etrx beobachtet werden. Während in den Einzelmutanten der Elektronenfluss innerhalb des CcdA-Etrx-MsrAB2-Systems unverändert war, zeigte sich in den Doppelmutanten ccdA1/ccdA2 und etrx1/etrx2 eine deutliche Beeinträchtigung der Elektronenübertragung auf MsrAB2, welche sich in der Zunahme der oxidierten Form von MsrAB2 deutlich machte. Somit konnte der Elektronenfluss von sowohl von CcdA1 über Etrx1 zu MsrAB2 als auch von CcdA2 über Etrx2 zu MsrAB2 in vivo betätigt werden. In Anbetracht der Ergebnisse dieser Arbeit könnte das hochkonservierte CcdA-Etrx-MsrAB2-System der extrazellulären oxidativen Stress-Resistenz von S. pneumoniae zur Entwicklung proteinbasierter Pneumokokken-Impfstoffe und zum Angriffspunkt für Behandlungen gegen diese wichtigen humanpathogenen Erreger beitragen.
  • Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is a Gram-positive and catalase negative human specific commensal of the upper and lower respiratory tract. Pneumococci are dreaded as the etiologic agent of respiratory and life-threatening invasive diseases such as pneumonia, meningitis and septicemia. Young children, elderly, and immunocompromised individuals belong to groups being of high risk to acquire pneumococcal infections. As colonizers of the human respiratory tract S. pneumoniae is forced to develop efficient strategies to resist host defense mechanisms such as the oxidative burst of the innate immune system. In addition to the reactive oxygen species (ROS) produced by the host pneumococci have to cope with endogenously formed hydrogen peroxide, which is endogenously produced by pneumococci as a chemical weapon against other bacterial competitors. This study discovers the unique molecular architecture of a highly conserved two-pathway system responsible for the extracellular oxidative stress resistance and its impact on pneumococcal virulence. This complex system is composed of two integral cytochrome C-like membrane proteins (CcdA1 and CcdA2), two thioredoxin-like lipoproteins (Etrx1 and Etrx2) and a single methionine sulfoxide reductase AB2 (MsrAB2), which are encoded in two spatially separated but functionally connected operons. The impact of the Etrx proteins and their electron acceptor MsrAB2 on pneumococcal pathogenesis was assessed in mouse virulence studies and phagocytosis assays using insertion-deletion mutants of S.pneumoniae D39. The results of this study revealed that loss of function of either both Etrx proteins or MsrAB2 dramatically attenuated pneumococcal virulence in the acute mouse pneumonia model. The pneumonia model further indicated that Etrx2 compensates for the absence of Etrx1 and vice versa. In addition, the deficiency of both Etrx proteins and MsrAB2, respectively, enhanced bacterial uptake by macrophages, and accelerated pneumococcal killing by H2O2. Deciphering the crystal structures of both thioredoxin-like proteins, Etrx1 and Etrx2, and modeling the remaining components involved in this resistance mechanism has also contributed to a better understanding of the role of each protein in the repair of damaged surface proteins. The proposed model for the oxidative stress defense on the pneumococcal cell surface was further verified by functional studies to elucidate the interaction between the thioredoxin-like lipoproteins Etrx1 and Etrx2 and the individual methionine sulfoxide reductase domains A and B. The results of the determination of the redox potentials confirmed the predictions made, suggesting that electron flow from Etrx1 or Etrx2 to MsrAB2 is possible. The calculated redox potentials suggest that the electrons can be transfereed from Etrx1 or Etrx2 to the putative redox partner MsrAB2. However, kinetic experiments revealed that Etrx1 preferably interacts with the MsrA2 subunit, while Etrx2 can interact with both the MsrA2 and MsrB2 subunit of MsrAB2. The in vivo redox state of MsrAB2 in the individual deletion mutants was determined using non-reducing/reducing diagonal SDS-PAGE. In the double mutants ccdA1/ccdA2 or etrx1/etrx2 MsrAB2 was increasingly present in the oxidized form, confirming the electron flow via both thioredoxins under in vivo conditions. In conclusion, this study identified and characterized on the molecular, structural and functional level a highly conserved pneumococcal two-pathway system of extracellular oxidative stress resistance. Since its exposure to the immune system it can be anticipated that the individual components of the thioredoxin-system can be used as targets for bactericides and the development of protein-based pneumococcal vaccines against these important human pathogens.

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Metadaten
Author: Malek Saleh
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001743-9
Title Additional (English):Impact of surface-exposed thioredoxin lipoproteins Etrx1 and Etrx2 on oxidative stress resistance and pathogenicity of Streptococcus pneumoniae
Advisor:Prof. Dr. Sven Hammerschmidt
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2014/03/07
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2014/03/05
Release Date:2014/03/07
Tag:Diagonalassay, Etrx, Mausmodell, MsrAB2, Proteinreparatur
Etrx, MsrAB2, diagonal assay, mouse model, protein repair
GND Keyword:Lipoproteine, Oxidativer Stress, Pneumonie, Streptococcus pneumoniae, Thioredoxin
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Mikrobiologie - Abteilung für Genetik & Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie