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Die Rolle von GSK-3β bei der rezeptorvermittelten Signaltransduktion am Beispiel des Adenosinrezeptoragonisten NECA unter besonderer Betrachtung von Src und PI3K

  • Am Tiermodell führt eine ischämischer Prä- bzw. Postkonditionierung zum Schutz des Myokards vor dem Ischämie /Reperfusionsschaden. Auch mittels zahlreicher pharmakologisch wirksamer Substanzen kann eine der Konditionierung ähnliche Schutzwirkung erreicht werden. Vorversuche unserer Arbeitsgruppe an ischämischen Kaninchenherzen haben gezeigt, dass die Behandlung mit dem Adenosinrezeptoragonisten NECA während der Reperfusion kardioprotektiv wirkt und zur Phosphorylierung von GSK-3β führt. Auch eine direkte Inhibition, der in ruhenden Zellen aktiven Kinase, GSK-3β mittels SB216763 wirkt kardioprotektiv und dieser Schutz scheint abhängig von PI3K und Src zu sein. Ziel dieser Arbeit war es, die am ganzen Herzen erhobenen Daten an einem Modell isolierter adulter Rattenkardiomyozyten zu überprüfen und insbesondere die Stellung der GSK-3β , PI3K und Src im NECA-vermittelten Signalweg genauer zu charakterisieren. Hierfür sollten genetisch veränderte Varianten von GSK-3β (Wildtyp, dominant negativ, konstitutiv aktiv) in Kardiomyozyten überexprimiert werden und die Zellen anschließend einem der Reperfusion entsprechenden oxidativen Stress unterzogen werden. Die Messung des mitochondrialen Membranpotentials nach 40 Minuten Peroxidstress diente dabei als Marker einer irreversiblen Zellschädigung. Die Behandlung der gestressten Kardiomyozyten mit NECA zeigte zwar eine protektive Wirkung. Diese war jedoch im Vergleich zur Kontrollgruppe nicht signifikant, sodass dieser Wirkstoff bei den weiteren geplanten Versuchen leider nicht genutzt werden konnte. Dem hingegen konnte für die Inaktivierung von GSK-3β mittels der Inhibitoren SB216763 und SB415286 die protektive Wirkung im Zellmodell bestätigt werden. Da der PI3K-Inhibitor Wortmannin bereits alleine einen gewissen Schutz vor Peroxidstress bewirkte, konnte diese Substanz nicht dazu beitragen, die Stellung der PI3K im SB216763-vermittelten Schutz zu lokalisieren. Eine Inaktivierung von Src mittels PP2 hatte entgegen unseren Vorversuchen keinen Effekt auf den SB216763-vermittelten Schutz. In diesem Modell scheint Src dementsprechend nicht unterhalb der GSK-3β lokalisiert zu sein. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Kardiomyozyten mittels adenoviraler Transfektion zur Expression einer Wildtyp (wt), einer dominant negativen (dn, Lys85Arg) und einer konstitutiv aktiven (ca, Ser9Ala) Variante von GSK-3β gebracht. Da wt-GSK-3β -transfizierte Zellen unter Peroxidstress eine den untransfizierten Zellen ähnliche Reaktion zeigten, war das Zellmodell geeignet, die Reaktion der Zellen nach dn- und ca-GSK-3β Expression genauer zu untersuchen. Dn GSK-3β transfizierte Kardiomyozyten wurden den SB216763-behandelten Zellen vergleichbar vor Peroxidstress geschützt und auch hier konnte die Schutzwirkung nicht durch Src Inhibition blockiert werden. Entgegen der Erwartungen war ca-GSK-3β nicht in der Lage, den SB216763-vermittelten Schutz zu unterbinden, obwohl Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe bereits eine ca GSK-3β -vermittelte Blockade des Opioidrezeptor induzierten Schutzes demonstrieren konnten. Somit konnte in dieser Arbeit die protektive Wirkung einer Inaktivierung von GSK-3β bestätigt werden. Aussagen zur Lokalisation der Kinasen PI3K und Src konnten jedoch leider nicht getroffen werden. Für weitergehende Untersuchungen besteht aber die Möglichkeit, mittels adenoviraler Transfektion die GSK-3β -Aktivität hochspezifisch zu beeinflussen.
  • In animal models, ischemic pre- and postconditioning of perfused hearts protect the heart from ischemia/reperfusion injury. Similar protective effects can be achieved by pharmacological treatment of ischemic hearts. Preliminary studies of our workgroup with ischemic ex vivo perfused rabbit hearts revealed that administration of the adenosine receptor agonist NECA during reperfusion reduces infarct size and causes phosphorylation of GSK-3β, a sign for enzyme inactivation. Inactivation of GSK-3β using SB216763 reduces myocardial infarction. This protection of the myocardium by GSK-3β inactivation seems to be dependent on PI3K and Src activation. The objective of this thesis was the verification of the data described above and the elucidation of the role of GSK-3β, PI3K and Src in the NECA-induced signal transduction using an in vitro model of isolated rat cardiomyocytes. For this purpose, genetic altered variants of GSK-3β were overexpressed in cardiomyocytes. Subsequently, the cells were exposed to hydrogen peroxide to simulate oxidative stress during reperfusion. As indicator for irreversible cell injury, the mitochondrial membrane potential was measured after 40 min of peroxide stress. Treatment with NECA protected hydrogen peroxide stressed cardiomyocytes. However, compared to the control group this effect was not significant therefore NECA was not used for further experiments. The protection of cells due to the inactivation of GSK-3β via SB216763 und SB415286 was confirmed. Since the PI3K inhibitor Wortmannin itself protected against oxidative stress, it was not suitable for further experiments. Since inactivation of Src using PP2 could not abolish SB216763 induced protection, in the used cell model, the enzyme seems not to be located below GSK-3β. In the second part of this thesis we used adenoviral transfection with genetically altered GSK-3β DNA to induce the expression of a wild type (wt), a dominant negative (dn, Lys85Arg) and a constitutively active (ca, Ser9Ala) variant. Wt-GSK-3β transfected cells showed a similar reaction towards hydrogen peroxide stress as untransfected cells. Therefore, the used cell model is adequate for studies with genetic altered GSK-3β. By overexpression of dn GSK-3β the cardiomyocytes were similarly to SB216763 treated cells, protected from oxidative stress and in both groups Src could not block protection. In contrast to our expectations, ca-GSK-3β could not prevent SB216763 induced protection although our workgroup had already shown that ca GSK-3β abolishes opiodreceptor activation dependent cell protection. In summary, the protective effect of GSK-3β inactivation could be confirmed. It was not possible to further elucidate role of PI3K and Src in adenosine or GSK-3β mediated signal transduction. Overexpression of genetic variants of GSK-3β leads to highly specific modulation of GSK-3β activity and is thereby an appropriate tool for further studies concerning the role of GSK-3β in cardioprotection.

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Metadaten
Author: Heike Richter
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002047-1
Title Additional (English):The role of GSK-3β in receptor mediated signal transduction using the adenosine receptor agonist NECA and especially regarding Src und PI3K
Advisor:Dr. Thomas Krieg, Dr. Karina Grube, Prof. Dr. Stephan B. Felix
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2014/11/04
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Universitätsmedizin (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2014/09/08
Release Date:2014/11/04
Tag:GSK-3Beta, NECA, adenovirale Transfektion
GND Keyword:Adenosinrezeptor, Glykogensynthase, Myokardprotektion, Präkonditionierung, Reperfusion
Faculties:Universitätsmedizin / Klinik und Poliklinik für Innere Medizin
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit