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Functional characterization of human class I and class II mitochondrial glutaredoxins

  • Class I and class II glutaredoxins (Grxs) are glutathione (GSH)-dependent proteins, that function as oxidoreductases (class I) or mediate cellular iron trafficking (class II). Some members of class I Grxs like human Grx2 are able to complex a [2Fe-2S] cluster and form a dimeric holo complex, which renders them catalytically inactive and is the basis for their function as redox sensors. Class II Grxs like human Grx5 also complex [2Fe-2S] clusters, however these proteins transfer the clusters to other proteins. Both functionally distinct classes share a similar thioredoxin fold and conserved interaction sites for the non-covalently binding of GSH, which is required to complex the [2Fe-2S] cluster. Furthermore, the proteins from both classes contain a highly nucleophilic active site cysteine that would allow both classes to catalyze GSH-dependent oxidoreduction reactions. Despite of these similar features, only class I Grxs are able to form a mixed disulfide with GSH and to reversibly transfer it to protein thiols (de-/glutathionylation). Interestingly, neither class I Grxs nor class II Grxs can effectively compensate the loss of an essential member of the other class. Even though some structural differences were described earlier, the basis for their different functions remained unknown. In particular, the lack of catalytic activity of class II Grxs as oxidoreductases could not be explained. Here, we demonstrate that the different conformations of a conserved lysyl side chain are the molecular determinant of the oxidoreductase or Fe-S transfer activity of class I and II Grxs, respectively. A specific loop structure that is conserved in all class II Grxs determines one lysyl conformation that prevents the formation of a mixed disulfide of the active site cysteinyl thiol with GSH. Using engineered mutants of hGrx2 and hGrx5, we demonstrated that the exchange of the distinct loop between the classes results in a loss of oxidoreductase function of class I hGrx2 and the gain of oxidoreductase activity of class II hGrx5. The altered GSH binding mode also profoundly changes the [2Fe-2S] cluster binding of the engineered mutants and thereby also influences stability of the holo complexes, a pre-determinant for [Fe-S] cluster transfer activity. With the minor shift of 2 Å in a conserved lysyl side chain orientation we were not only able to modify the catalytic activity of two small human mitochondrial proteins, but on a much larger scale also provided evidence for the previously unknown structural basis that determines the function of all class I and class II Grxs. The oxidoreductase activity of hGrx2 was also analyzed in vivo in a model of doxorubicin cell toxicity. Applying a mass spectrometrical approach, we identified various mitochondrial proteins as targets for redox regulation. Furthermore, our results gave reason to reconsider some common assumptions regarding doxorubicin-induced apoptosis and the protective function of mitochondrial Grx2.
  • Die glutathionabhängigen Glutaredoxine (Grxe) der Klasse I und II agieren als Oxidoreduktasen (Klasse I) oder sind am Transfer von Eisen bzw. [Fe-S] Clustern beteiligt (Klasse II). Die Fähigkeit einiger Klasse I Grxe, wie z.B. humanem Grx2, einen [2Fe-2S] Cluster zu binden, führt zu ihrer enzymatischen Inaktivität, was es ihnen ermöglicht in der Zelle als Redoxsensor zu fungieren. Grxe wie humanes Grx5 aus der Klasse II können ebenfalls einen [2Fe-2S] Custer binden, diesen jedoch gezielt an andere Proteine weiterleiten. Auch wenn die beiden Klassen sich funktionell deutlich unterscheiden, besitzen sie einen sehr ähnlichen strukturellen Aufbau, der für alle Proteine der Thioredoxin-Familie gleich ist. Zusätzlich findet man hochkonservierte Interaktionsstellen für die nicht kovalente Bindung von Glutathion (GSH), welches für die Bindung von [2Fe-2S] Clustern benötigt wird. Außerdem enthalten die aktiven Zentren ein stark nukleophiles Cystein, welches beiden Klassen theoretisch ermöglichen würde Oxidoreduktase-Reaktionen zu katalysieren. Trotz dieser Gemeinsamkeiten können nur Klasse I Grxe gemischte Disulfide mit GSH bilden und dieses reversibel auf Zielproteine übertragen (De-/Glutathionylierung). Interessanterweise können die Funktionen der einzelnen Klassen bei einem Verlust auch nicht von der jeweils anderen Klasse übernommen werden. Auch wenn einige strukturelle Unterschiede beschrieben wurden, ist der Grund für die enzymatische Inaktivität der Klasse II Grxe bisher noch ungeklärt. In dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass die unterschiedlichen Konformationen einer konservierten Lysinseitenkette bestimmen ob ein Grx als Oxidoreduktase oder im [Fe-S]-Transfer fungiert. Bestimmt wird die Konformation des Lysins dabei von einer charakteristischen konservierten Loop-Struktur, sodass in Klasse II Grxen die Ausbildung eines gemischten Grx-GSH Disulfids mit dem Cystein des aktiven Zentrums verhindert wird. Mit Hilfe von Mutanten des hGrx2 und hGrx5, konnten wir nachweisen, dass der Austausch der Loop-Struktur zwischen den Klassen zu einem Verlust der Oxidoreduktase-Funktion bei hGrx2 und einer gesteigerten Oxidoreduktase-Aktivität bei hGrx5 führte. Zusätzlich wurde durch eine veränderte Interaktion mit GSH auch die Bindung des [2Fe-2S] Clusters beeinflusst, was in einer Stabilitätsänderung der gebildeten Holoprotein-Komplexe deutlich wird. Diese Besonderheit ist eine Grundvoraussetzung für die Fähigkeit einen Cluster weiterzugeben. Durch die kleine Änderung von 2 Å in der Seitenkette des konservierten Lysins konnten wir nicht nur die Aktivität der humanen mitochondriellen Grxe ändern, sondern stellen ebenfalls ein Modell zur Verfügung, das die bisher ungeklärte Ursache für die unterschiedliche Funktion aller Klasse I und Klasse II Grxe erklärt. Zusätzlich wurde auch die Oxidoreduktase-Aktivität von mitochondriellem Grx2 in vivo mit Hilfe von einem Zellmodell für Doxorubicin-induzierte Toxizität analysiert. Durch die Anwendung von Massenspektrometrie konnten wir eine Reihe von mitochondriellen Proteinen identifizieren, die Ziel von Redox-Modifikationen durch hGrx2 sind. Zusätzlich geben unsere Ergebnisse aber auch Anstoß dazu, einige verbreitete Annahmen bezüglich der Doxorubicin-induzierten Apoptose und der schützenden Wirkung von mitochondriellem hGrx2 zu überdenken.

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Metadaten
Author: Daniel Trnka
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-27636
Title Additional (German):Funktionelle Charakterisierung von humanen mitochondrialen Klasse I und Klasse II Glutaredoxinen
Referee:Prof. Dr. Christiane Helm, Prof. Dr. Marcel Deponte
Advisor:Dr. Christopher Horst Lillig, Prof. Dr. Christiane A. Helm
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Year of Completion:2018
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2019/06/28
Release Date:2019/07/10
Tag:Doxorubicin, Glutaredoxine, Glutathione, Mitochondrium, Oxidoreduktase, [Fe-S] Cluster, katalytische Aktivität
catalytic activity, glutaredoxins, oxidoreductase
GND Keyword:Biochemie, Doxorubicin, Glutaredoxin, Glutathion, Mitochondrium, Molekularbiologie, Proteine, Thiole, Thioredoxine
Volume:2018
Pagenumber:136
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Med. Biochemie u. Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie