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Molekularbiologische Ansätze zur Bekämpfung der Afrikanischen Schweinepest

  • In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene grundlegende Ansätze zur Prävention der Afrikanischen Schweinepest entwickelt und teilweise evaluiert. Die ersten beiden befassten sich mit der Impfstoffentwicklung, wobei einerseits eine vektorbasierte Strategie verfolgt und zum anderen auf eine attenuierte ASPV Lebendvakzine hingearbeitet wurde. Die dritte Herangehensweise war auf die Inhibierung der viralen Replikation in Schweinezellen mittels CRISPR/Cas9 fokussiert, um Hinweise auf die generelle Anwendbarkeit des Systems in transgenen Schweinen zu gewinnen. Der Pseudorabies-Virus Impfstamm Bartha (PrV-Ba) wurde als potenzieller Vektor für die Expression von ASPV-Antigenen im Schwein gewählt. Dazu wurde zunächst eine Methode etabliert, mit der PrV-Rekombinanten effizient generiert werden konnten. Dabei erwies sich die Verwendung eines artifiziellen bakteriellen Chromosoms (BAC), welches das infektiöse PrV-Genom enthielt, als hilfreich. In diesem wurde ein essentielles PrV-Gen inaktiviert, dass dann durch homologe Rekombination mit einem Transferplasmid in co-transfizierten Säugerzellen rekonstituiert werden konnte. Durch gleichzeitiges CRISPR/Cas9-vermitteltes Schneiden der BAC-DNA am gewünschten Insertionsort konnte die Rekombinationsrate weiter gesteigert werden. Diese Strategie wurde anschließend für die Insertion verschiedener ASPV Gene in das PrV-Genom genutzt, wobei unterschiedliche Promotoren und Kodonoptimierungen getestet wurden. In den meisten Fällen konnten durch Verwendung des CAG-Promotors und eine Kodonadaptation an porcine Gene die höchsten Expressionsraten erreicht werden. Somit wurde eine Methode entwickelt, mit der prinzipiell alle ASPV Gene im PrV Vektorsystem exprimiert und in Impfstudien getestet werden könnten. In der zweiten Untersuchung wurden zwei Proteine des ASPV mittels monospezifischer Antiseren näher charakterisiert und ASPV-Deletionsmutanten generiert, um Hinweise auf die Funktionen der Proteine zu erhalten. Bei diesen Proteinen handelte es sich um p285L und pK145R. Sie wurden anhand von Daten aus einer vorhergehenden Proteomanalyse von Keßler et al. (2018) ausgewählt, da sie in großen Mengen in ASPV infizierten Zellen nachgewiesen wurden und deshalb wichtige Funktionen (beispielweise auch Virulenz-determinierende Funktionen) haben könnten. Bei p285L handelt es sich um ein früh exprimiertes Virionprotein, das zunächst in den sogenannten Virusfabriken infizierter Wildschweinlungenzellen (WSL) akkumuliert. pK145R ist ein spätes ASPV Protein, das in Virionen nicht nachweisbar ist und eine diffuse Verteilung im Zytoplasma infizierter Zellen zeigt. Beide Proteine sind für die Virusreplikation nicht essentiell, und ihre Deletion führte zu keiner (285L) oder einer nur mäßigen (K145R) Titerreduktion in infizierten WSL Zellen oder primären Blutzellkulturen (PBMC). Durch in vivo Analysen der Deletionsmutanten muss nun geklärt werden, ob p285L und pK145R für die Virulenz bzw. die Wechselwirkung von ASPV mit dem Wirtsimmunsystem wichtig sind und ob sich die Mutanten deshalb als lebend attenuierte Impfstoffe eignen könnten. In der dritten Studie wurde untersucht, ob das CRISPR/Cas9 System zur Inhibition der ASPV Infektion in vitro geeignet ist. Dazu wurden WSL-Zelllinien generiert, die Cas9 und verschiedene sgRNAs konstitutiv exprimierten. Durch die Expression einer sgRNA gegen das Gen des ASPV Phosphoproteins p30 (CP204L) wurde die Virusreplikation nahezu komplett inhibiert. Die Spezifität des Effektes konnte durch parallele Versuche mit einem Virusisolat, dessen Zielsequenz nicht mit der genutzten sgRNA Sequenz übereinstimmte, gezeigt werden. Dieses ASPV Isolat konnte im Gegensatz zum Virus mit der passenden Zielsequenz in den rekombinanten Zellen genauso gut replizieren, wie in nicht modifizierten Zellen. Zudem wurde die Spezifität durch die Analyse von sporadisch auftretenden Escape-Mutanten bestätigt, die verschiedene Basenaustausche in der Zielsequenz aufwiesen. Somit konnte gezeigt werden, dass das CRISPR/Cas9 System eine effiziente Inhibition der ASPV Replikation in Zellkultur bewirken kann und deshalb möglicherweise auch in entsprechenden transgenen Schweinen eine Resistenz gegen letale ASPV-Infektionen vermitteln könnte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in allen drei Studien grundlegende Experimente erfolgreich durchgeführt wurden, die zur Prävention der Afrikanischen Schweinepest beitragen können.
  • Because of the current spread of African swine fever (ASF) in Europe and Asia, measures for prevention are urgently needed. Different strategies for such interventions were the focus of the present studies. The first two of them were dealing with vaccine development, namely vector based vaccines and live attenuated vaccines. The third topic of this thesis focused on evaluation of the suitability of the CRISPR/Cas9 technology for inhibition of African swine fever virus (ASFV) replication in cell culture, as a prerequisite for breeding of ASFV-resistant transgenic pigs. For a potential vector based vaccine, a pseudorabies virus vaccine strain (PrV-Ba) was chosen for antigen delivery to pigs. Therefore, a method for simple and efficient generation of PrV-Ba recombinants based on an infectious bacterial artificial chromosome (BAC) containing the complete viral genome was developed. An essential PrV gene within this BAC was inactivated and subsequently restored by homologous recombination with a transfer plasmid in co-transfected mammalian cells. The efficiency of homology directed repair (HDR) was further improved by simultaneous CRISPR/Cas9-mediated cleavage of the BAC DNA at the intended insertion site. This method was then used to generate several PrV-Ba mutants expressing ASFV proteins using different promoters and enhancers, intervening sequences, and codon optimizations in combination. In most cases, the use of the CAG promoter and codon adaptation to porcine genes led to the highest transgene expression rates. The developed strategy should be suitable for generation of PrV-Ba mutants expressing all known ASFV proteins for vaccination studies. In the second study, two ASFV proteins (p285L and pK145R) were characterized using monospecific antisera, and corresponding ASFV deletion mutants were generated to elucidate the protein functions. The two proteins were chosen, since they were among the most abundant viral gene products detected in proteome analyses of ASFV-infected wild boar lung (WSL) cells (Keßler et al., 2018), suggesting important functions. The analyses showed that p285L is an early expressed virion protein, which is located in virus factories of infected WSL cells. In contrast, pK145R is a true late protein, which is diffusely distributed in the cytoplasm of infected cells, and not detectable in virus particles. Both proteins were shown to be dispensable for in vitro replication of ASFV and their deletion caused no (285L) or only marginal (K145R) titer reductions in infected WSL cells or peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Because in vitro and in vivo replication do not always correlate, animal experiments have to be performed to elucidate whether these proteins play a role in virulence or immune evasion, and whether the deletion mutants might be candidates for live attenuated virus vaccines. In the third study, the efficacy of the CRSIPR/Cas9 system for inhibition of ASFV replication was evaluated in vitro. Transgenic WSL cell lines expressing Cas9 nuclease and sgRNAs targeting different essential ASFV genes were generated. The most promising results were obtained using WSL cells with a sgRNA directed against the gene of the immunogenic phosphoprotein p30 (CP204L), in which an almost complete inhibition of ASFV replication could be achieved. The specificity of this effect was demonstrated using an ASFV isolate with a non-matching target sequence. This virus showed no growth inhibition in the recombinant cells that inhibited viruses with a matching target sequence. The occasional occurrence of escape mutants with altered targeted sequences additionally confirmed CRISPR/Cas9 specificity. Thus, this system is suitable for efficient inhibition of ASFV replication in vitro, and it remains to be elucidated whether similar results can be achieved in corresponding transgenic pigs. In summary, the results of the fundamental experiments carried out in the present studies might contribute to eventual prevention of ASF in domestic pigs and wild boar.

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Metadaten
Author: Alexandra Hübner
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-25089
Title Additional (English):Molecular biological approaches to combat African swine fever
Referee:Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas C. Mettenleiter, Prof. Dr. vet. med. Till Rümenapf
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2018
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2019/02/12
Release Date:2019/02/27
GND Keyword:Afrikanisches Schweinepest-Virus, Herpesvirus suis
Pagenumber:113
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie