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Transaminase-vermittelte Synthese β-chiraler Amine

  • β-chirale Amine, wie zum Beispiel Pregabalin und Baclofen, sind Verbindungen von großem Interesse insbesondere für die pharmazeutische Industrie. Biokatalytische Herstellungsverfahren, vor allem Aminierungsreaktionen, sind bisher nur geringfügig untersucht worden und werden nach aktuellem Wissenstand bis auf die Synthese von Niraparib noch nicht in großtechnischem Maßstab eingesetzt. Wünschenswert ist die Etablierung einer Synthese, welche (S)-Pregabalin bzw. (R)-Baclofen in hohen Ausbeuten liefert, da diese beiden Enantiomere jeweils die höhere biologische Wirksamkeit aufweisen. Ziel dieser Arbeit war die Synthese von Pregabalin und Baclofen als Modellverbindungen für β-chirale Amine mit Hilfe einer selektiven Amintransaminase oder Amindehydrogenase. Zunächst wurde erfolgreich mit Hilfe der Gaschromatographie bzw. HPLC jeweils eine chirale Analytik für die beiden Reaktionsprodukte sowie die Baclofen-Derivate etabliert, die stabil reproduzierbar und auch zur Quantifizierung geeignet war. Auch für 3-(4-Chlorphenyl)-4-oxo-buttersäure-t-butylester konnte eine GC-Methode entwickelt werden, die Aufschluss über die Konzentration und den Enantiomerenüberschuss gab. Die vier zur Verfügung gestellten Amindehydrogenasen konnten erfolgreich exprimiert und mittels IMAC-Methode gereinigt werden. Trotz geringer Aktivitäten in einem photometrischen NADH-Assay konnte jedoch keine Produktbildung nachgewiesen werden. Eine Kollektion von ca. 150 Amintransaminasen wurde bezüglich der Desaminierung von Pregabalin und Baclofen mittels Dünnschichtchromatographie untersucht. In Richtung der Aminierung wurde ein photometrischer Acetophenon-Assay verwendet. Dabei wurden für Pregabalin sechs und für Baclofen 17 potenzielle Kandidaten ermittelt. Besonders vielversprechend war die Variante 3FCR 59W 87L 231A 382M 429A (3FCR_5M), welche 3-(4-Chlorphenyl)-4-oxo-buttersäure-t-butylester als Substrat akzeptierte. Nach der Ermittlung eines geeigneten Aminodonors und Optimierung der Reaktionsbedingungen konnten Umsätze bis zu 90% bei 99%ee (R) mit IMAC-gereinigter 3FCR_5M erzielt werden. Um Kosten für ein späteres großtechnisches Verfahren einzusparen, sollte die Reaktion ebenfalls für den Einsatz von Zellextrakt optimiert werden. Dabei wurde beobachtet, dass geringere Enantiomerenüberschüsse erzielt wurden als mit dem gereinigten Enzym und der Substratverbrauch höher als die Produktbildung war. Als mögliche Ursachen wurden der Umsatz des Substrats durch ein E. coli eigenes Enzym, beispielsweise eine Aldehydreduktase oder Aldehyddehydrogenase, sowie eine Beeinflussung der Enantioselektivität durch die veränderte chemische Umgebung oder den selektiven Entzug des gewünschten Substrat-Enantiomers durch eine selektive Nebenreaktion hypothetisiert. Dieses Phänomen konnte durch eine vorgeschaltete Reinigung mittels fraktionierender Ammoniumsulfat-Fällung jedoch erfolgreich umgangen werden. Mit dieser Methode konnten vergleichbar hohe Umsätze und Enantiomerenüberschüsse wie mit dem IMAC-gereinigten Enzym erreicht werden. Bei ersten Vorversuchen zum Up-Scaling der Reaktion wurde festgestellt, dass eine höhere Substratkonzentration nicht einen proportional höheren Umsatz zur Folge hatte, jedoch konnte der Umsatz durch eine versetzte Zugabe der Enzymlösung gesteigert werden, sodass ein Prozess mit diesem Biokatalysator in seiner aktuellen Form eine kontinuierliche Zugabe erfordern würde. Praktikabel wäre einer Verminderung der Substrat-Inhibierung und Erhöhung der Enzymstabilität durch weiteres Protein-Engineering. Auch zur Produktion von 3FCR_5M im größeren Maßstab wurden Experimente vorgenommen. Dabei konnte gezeigt werden, dass eine vielversprechende Expression im Bioreaktor bei einer kontinuierlichen Temperatur von 30°C und einer Expressionsdauer von sieben Stunden. Nach einigen Optimierungsschritten konnte im Bioreaktor die zwanzigfache volumetrische Aktivität im Vergleich zur Expression im Schüttelkolben erzeugt werden. Zusammenfassend ist zu sagen, dass in der vorliegenden Arbeit, trotz weiterem Optimierungsbedarf, eine sehr gute Grundlage für die Transaminase-vermittelte Synthese von (R)-Baclofen geschaffen wurde. In zukünftigen Arbeiten sollte die Optimierung der Reaktion in großem Maßstab im Fokus stehen.
  • β-chiral amines, such as pregabalin and baclofen, are compounds of great interest, especially to the pharmaceutical industry. Biocatalytic preparation methods, especially amination reactions, have only been studied to a minor extent and, according to current knowledge, are not yet used on an industrial scale, except for the synthesis of niraparib. It is desirable to establish a synthesis which yields (S)-pregabalin or (R)-baclofen in high yields, since these two enantiomers each have the higher biological activity. The aim of this work was the synthesis of pregabalin and baclofen as model compounds for β-chiral amines using a selective amine transaminase or amine dehydrogenase. First, a chiral analysis for the two reaction products and the baclofen derivatives was established successfully with the aid of gas chromatography or HPLC, which was stable, reproducible, and also suitable for quantification. For 3-(4-chlorophenyl)-4-oxo-butyric acid t-butyl ester, a GC method was also developed, which gave information about the concentration and the enantiomeric excess. The four provided amine dehydrogenases were successfully expressed and purified by the IMAC method. However, despite low activity in a photometric NADH assay, no product formation could be detected. A collection of approximately 150 amine transaminases was screened for the deamination of pregabalin and baclofen by thin layer chromatography. In the direction of the amination, a photometric acetophenone assay was used. There were six potential candidates for pregabalin and 17 candidates for baclofen. Particularly promising was the variant 3FCR 59W 87L 231A 382M 429A (3FCR_5M), which accepted 3-(4-chlorophenyl)-4-oxo-butyric acid t-butyl ester as a substrate. After finding a suitable amine donor and optimizing the reaction conditions, it was possible to achieve conversions of up to 90% at 99% ee (R) with IMAC-purified 3FCR_5M. To save costs for a later large-scale process, the reaction should also be optimized for the use of cell extract. It was observed that lower enantiomeric excesses were achieved than with the purified enzyme and substrate consumption was higher than product formation. As possible causes, the conversion of the substrate by an E. coli enzyme, for example an aldehyde reductase or aldehyde dehydrogenase, and an influence on the enantioselectivity by the altered chemical environment or the selective removal of the desired substrate enantiomer by a selective side reaction were hypothesized. However, this phenomenon was successfully bypassed by upstream purification using fractional ammonium sulfate precipitation. With this method, comparably high conversions and enantiomeric excesses could be achieved, as with the IMAC-purified enzyme. Initial preliminary upscaling of the reaction found that a higher substrate concentration did not result in a proportionally higher conversion, however, the conversion could be increased by a staggered addition of the enzyme solution, so that a process with this biocatalyst in its current form would require continuous addition. It would be practical to reduce substrate inhibition and increase enzyme stability through further protein engineering. Experiments were also performed on the larger scale production of 3FCR_5M. It could be shown that a promising expression in the bioreactor at a continuous temperature of 30°C and an expression period of seven hours. After some optimization steps, the bioreactor was able to generate twenty times the volumetric activity compared to the expression in the shake flask. In summary, in the present work, despite further optimization needs, a very good basis for the transaminase-mediated synthesis of (R)-Baclofen was created. Future work should focus on optimizing the reaction on a large scale.

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Metadaten
Author: Miriam Anne Sowa
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-25596
Title Additional (English):Transaminase-mediated Synthesis of β-chiral Amines
Referee:Dr. Matthias Höhne, Prof. Dr. Harald Gröger
Advisor:Dr. Matthias Höhne
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2019
Date of first Publication:2019/03/27
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2019/03/08
Release Date:2019/03/27
Tag:Chirale Amine, Transaminase
GND Keyword:Baclofen, Biochemie, Biokatalyse
Pagenumber:100
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie