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Generierung eines bicistronischen DNA-Impfstoffes basierend auf der Tyrosinhydroxylase und Interleukin 15 in Kombination mit einer PD-1-gerichteten Immuncheckpoint-Blockade zur aktiven Immuntherapie beim Neuroblastom

  • Als hochmaligner Tumor stellt das Neuroblastom ausgehend vom sympathischen Nervensystem den häufigsten soliden, extrakraniellen Tumor des Kindesalters dar. Aufgrund seiner heterogenen Charakteristik und teils höchst aggressiven Wachstums bedarf es besonders im Hinblick auf die hohe Rezidivrate von Hochrisikopatienten neuer innovativer Therapien, die einen langanhaltenden Anti-Tumoreffekt induzieren. Durch zunehmende Erkenntnisse auf dem Gebiet der Tumorimmunologie sind dabei besonders immuntherapeutische Behandlungsstrategien immer weiter in den Vordergrund gerückt. Diese führen zur spezifischen Aktivierung des körpereigenen Immunsystems verbunden mit der Erkennung und Eliminierung der Tumorzellen. In der Praxis ist eine wirksame Anwendung der aktiven Immuntherapie jedoch mit einigen Herausforderungen verbunden. Dazu gehören die Identifikation von geeigneten Tumorantigenen, die optimale Aufnahme, Prozessierung und Präsentation der Antigene durch Immunzellen sowie die Überwindung der Immuntoleranz zur Induktion zytotoxischer und Gedächtnis-T-Zellen. Auch die natürlichen Regulationsmechanismen sollten nicht außer Acht gelassen werden, da diese einerseits die anti-tumoralen Effekte einer resultierenden Immunantwort eindämmen können, jedoch andererseits gesundes Gewebe vor einer Autoimmunreaktion schützen. Ziel dieser Arbeit war es daher die bereits bekannte präklinische Wirksamkeit einer Tyrosinhydroxylase (TH)-gerichteten Immuntherapie gegen das Neuroblastom durch eine zusätzliche Immunstimulation mit dem Zytokin IL-15 und einer Immuncheckpoint-Blockade zu verbessern. Dafür wurde ein bicistronisches DNA-Vakzin generiert, welches sowohl für die cDNA der TH als auch die von IL-15 kodiert. Um dabei die Herstellung und MHC-I-vermittelte Präsentation antigener TH-Peptide, effektiv zu gestalten und die Immunigenität des Vakzins zu erhöhen, erfolgte die upstream-Kopplung einer modifizierten Ubiquitin-Sequenz an die der xenogenen TH. Die Integration der IL-15-Sequenz in das DNA-Vakzin ermöglicht eine auf die Mikroumgebung der Antigenpräsentation beschränkte lokale Applikation und kann so die Aktivierung zytotoxischer T-Zellen unterstützen ohne systemische Zytokin-bedingte Nebenwirkungen zu verursachen. Nach der Generierung des Vakzins erfolgte die In-vitro-Charakterisierung durch Transfektion von CHO-Zellen mit dem DNA-Vakzin, wobei die Plasmid-vermittelte Synthese der ubiquitinierten TH und Freisetzung von bioaktivem IL-15 bestätigt wurden. Die Evaluierung der anti-tumoralen Eigenschaften in vivo erfolgte in einem syngenen Mausmodell, wobei attenuierte S. typhimurium SL7207 als orales Applikationsvehikel für das DNA-Vakzin dienten, die durch die Stimulierung des mukosalen Immunsystems dem DNA-Vakzin eine gesteigerte Immunogenität verleihen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte der S. typhimurium-vermittelte Genransfer sowie die effektive Expression der im Vakzin enthaltenen Gene in den APC der Peyer Plaques nachgewiesen werden. Weiterhin konnten die durch zytotoxische T-Zellen vermittelte anti-tumoralen Effekte einer TH-basierten Immuntherapie, repräsentiert durch ein reduziertes Primärtumorwachstum sowie verminderter Metastasierung, durch die Ko-Expression von IL-15 in einem syngenen Mausmodell gesteigert werden. Interessanterweise führte die Immuncheckpoint-Blockade durch eine anti-PD-1-AK-Therapie sowohl mit als auch ohne Kombination mit dem DNA-Vakzin zu einem signifikanten Anstieg der anti-tumoralen Effekte. Dieses Ergebnis unterstreicht die nachteilige Rolle immunregulatorischer Mechanismen bei der Ausbildung einer zellulären Immunantwort durch eine Immuntherapie, was ergänzend durch den Nachweis immunsuppressiver Zytokine in der Tumormikroumgebung bestätigt wurde. Bei der Anwendung von Behandlungsstrategien zur aktiven Immunisierung ist daher die Blockierung der natürlichen Regulationsmechanismen sowie der tumor-induzierten Immunsuppression von enormer Bedeutung. Zusammenfassend war das in dieser Arbeit generierte xenogene DNA-Vakzin in der Lage durch die Ko-Expression von IL-15 die NB-spezifischen Effekte der TH-gerichteten Immuntherapie zu steigern. Des Weiteren konnten mittels einer anti-PD-1-gerichteten Immuncheckpoint-Blockade immunregulatorische Prozesse unterbunden und dadurch die CTL-vermittelten anti-tumoralen Effekte der Target-gerichteten DNA-Vakzinierung verstärkt werden. Gerade bei schwach immunogenen Tumoren wie dem Neuroblastom sind Kombinationstherapien notwendig, welche eine TAA-gerichtet Immunantwort zur Induktion eines Immunologischen Gedächtnisses in Gang bringen und gleichzeitg die Regulationsmechanismen unterbinden, um so eine effektive Tumorbekämpfung zu ermöglichen. Diese vielversprechende Vakzinierungsstrategie könnte somit neuer immunologischer Ansatz für eine adjuvante Erhaltungstherapie für eine minimale Resterkrankung bei refraktären Neuroblastompatienten darstellen.
  • Neuroblastoma is a challenging pediatric malignancy originating from progenitor cells of the sympathetic nervous system. Although multimodal therapies, including passive GD2-directed immunotherapies, have significantly improved outcome of high-risk NB patients, the tumor’s heterogeneity and its aggressive growth still represent major obstacles for a successfull treatment of this devastating disease. In order to achieve a lifelong protection against cancer, therapeutic strategies aiming for the induction of a long-lasting anti-cancer immune response, in particular those that involve the activation of the patient’s own cellular immune system to eliminate tumor cells, are becoming increasingly attractive. Given the great potential of active immunotherapies, there are also major challenges for the development of effective therapeutic regiments, such as identification of feasible tumor antigens, as well as the optimal uptake, processing and presentation of antigens by immune cells. At the same time, the ability to overcome immune tolerance in order to induce cytotoxic CD8+ T cells and to silence immune suppressive mechanisms without causing an autoimmune reaction are important prerequisites for the development of effective active immunotherapies. Therefore, the aim of this study was to enhance the previously reported preclinical efficacy of a tyrosine hydroxylase (TH)-based immunotherapy through the co-expression of the immune stimulating cytokine IL-15 and a combinatorial immune checkpoint blockade. This was accomplished by creating a bicistronic DNA-vaccine encoding the cDNA sequence of TH and IL-15. To optimize the generation and MHC class I-mediated presentation of antigenic TH peptides and to improve immunogenicity, xenogenic DNA was used for TH in combination with an upstream ubiquitin sequence. The integration of the IL-15 cDNA sequence into the DNA-vaccine enabled the secretion of this co-stimulatory cytokine directly into the microenvironment of the antigen presentation resulting in a more effective CTL stimulation without causing systemic cytokine-related side effects. After transfection of CHO cells with the DNA vaccines, successful production of the vaccine-derived ubiquitinated TH protein and release of bioactive IL-15 were confirmed in vitro. For the evaluation of the vaccine’s anti-tumor effectivity using a syngeneic murine tumor model, attenuated Salmonella typhimurium SL7207 were used as oral application vehicle to induce an additional stimulation of the mucosal immune system. Here we showed that the cytotoxic T cell-based immune response induced by a TH-directed vaccination was further enhanced by the co-expression of IL-15 resulting in protection of mice from tumor growth and prevention of spontaneous metastasis. Interestingly, inhibition of the natural regulatory mechanisms using anti-PD-1 antibodies as immune checkpoint blockade both in combination with the DNA-vaccine and without showed significantly increased anti-tumor effectivity. These results together with the evidence of immune suppressive cytokine release into the tumor microenvironment underline the adverse role of immune regulatory mechanisms in the context of a cellular-based immune reaction caused by immunotherapeutic approaches. Hence, silencing of natural regulatory mechanisms as well as tumor-induced immunosuppression is of enormous importance for the design of treatment strategies for active immunization. All together, we generated and characterized a bicistronic xenogenic DNA vaccine encoding the NB-associated antigen TH and the immune stimulatory cytokine IL-15. We demonstrated that the immune response induced by TH-directed vaccination was further enhanced by the co-expression of IL-15. Furthermore, the application of anti-PD-1 antibodies as immune checkpoint blockade inhibited immune regulatory mechanisms and enhanced anti-tumor efficacy of the target-directed DNA vaccination. Especially, tumors with low immunogenity like neuroblastoma require a therapeutical regiment that combines the induction of a target-directed cellular immune respons including robust memory T-cells and silencing the regulatory mechanisms to ensure proper tumor eradication. Therefore, this therapeutic strategy might provide a promising adjuvant immunological approach for maintenance therapy of refractory neuroblastoma patients.

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Metadaten
Author: Madlen Marx
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-25561
Title Additional (English):Generation of a bicistronic DNA vaccine encoding tyrosine hydroxylase and interleukin 15 combined with a PD-1-directed immune checkpoint blockade for active immunotherapy against neuroblastoma
Referee:Prof. Dr. rer. nat. Uwe T. Bornscheuer, Prof. Dr. med. Holger N. Lode, PD Dr. med. Patrick Hundsdörfer
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2019
Date of first Publication:2019/03/20
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:0019/03/15
Release Date:2019/03/20
GND Keyword:Immuntherapie, Neuroblastom
Pagenumber:118
Faculties:Universitätsmedizin / Klinik und Poliklinik für Kinder- und Jugendmedizin
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit