Hannes Wolfgramm

• Bacterial infections are among the leading causes of death worldwide. Despite the success achieved through the introduction of antibiotics, treatment of such infections remains a major challenge, as bacterial pathogens constantly undergo evolutionary adaptation. Consequently, antimicrobial resistance has become a serious burden on global healthcare systems. Due to its widespread prevalence and the high proportion of resistant strains, Staphylococcus aureus is considered one of the most clinically relevant pathogens. Moreover, S. aureus is responsible for a broad spectrum of infectious diseases, ranging from skin inflammations to sepsis and chronic infections. Accordingly, novel therapeutic approaches targeting S. aureus are of significant interest. For the development of new therapies, a thorough understanding of the underlying virulence mechanisms is essential. Because in vitro methods can only reflect a limited portion of the complexity present within the host, animal models are a crucial component of infection research. As with many bacterial pathogens, the mouse model represents the most widely used system for studying S. aureus infections. However, the commonly employed combination of a clinical S. aureus isolates and the mouse as infection host often fails to accurately replicate the clinical course of infections. A promising alternative for improving the mouse model is provided by mouse-adapted S. aureus strains, which have been increasingly applied in recent years. One of the most frequently used mouse-adapted strains is JSNZ, originally isolated from preputial gland abcesses of C57BL/6 mice. JSNZ has demonstrated the ability to cause both chronic colonization and acute infections in the murine model. Its high transformability further facilitates genetic manipulation and molecular studies of virulence, making it an ideal candidate for standardization as a reference strain. This doctoral thesis focuses on the characterization of JSNZ as a reference strain for mouse-adapted S. aureus in infection research. The genome sequence of JSNZ was completed and made available on AureoWiki, including functional annotations and regulon prediction. In addition, the proteome under standard laboratory conditions was recorded and analyzed. Notably, an exceptionally high abundance of the serine protease Jep (JSNZ extracellular protease) was detected in the culture supernatant. During the stationary growth phase in full medium (TSB), approximately 74% of the total protein content was attributed to this single protein. Previous studies have also shown that jep is almost exclusively present in mouse-adapted S. aureus isolates. In line with these findings, additional analyses in this doctoral thesis placed particular emphasis on Jep. Primarily, the plasmid system pTripleTREP was established for homologous expression and rapid purification of Jep and other secreted virulence factors in S. aureus. pTripleTREP features a newly designed anhydrotetracycline-inducible promoter that completely suppresses expression under non-inducing conditions. Additionally, secreted target proteins can be purified directly from the culture supernatant via a high-affinity Twin-Strep-tag. In a single purification step, pure and active S. aureus proteases were obtained and used for further characterization, including N-terminomics approaches to identify potential Jep substrates. The results suggest proteolytic processing of endogenous S. aureus virulence factors and, consequently, a modulation of virulence expression mediated by Jep. Beyond protein overexpression and purification, this thesis also demonstrated further applications of pTripleTREP and related plasmid systems for studying bacterial physiology. These include conditional gene complementation with adjustable expression levels and promoter analysis using fluorescence reporters. While the latter functionality was initially implemented in Bacillus subtilis, a S. aureus-adapted version of the plasmid is intended for future studies investigating the transcriptional regulation of jep. In summary, this doctoral thesis provided essential resources for establishing JSNZ as a reference strain for mouse-adapted S. aureus in infection research. These include the complete genome sequence, proteomic profiling under laboratory conditions, and molecular tools for further investigation of individual virulence factors and physiology. The findings obtained indicate that Jep plays a significant role in JSNZ, highlighting an urgent need to elucidate the underlying molecular mechanisms to assess their relevance in the context of mouse model applications.
• Bakterielle Infektionen sind eine der Haupttodesursachen weltweit. Trotz der Erfolge durch die Einführung von Antibiotika bleibt die Eindämmung und Behandlung solcher Infektionen eine enorme Herausforderung, da die bakteriellen Erreger sich fortwährend evolutiv anpassen. So sind antimikrobielle Resistenzen inzwischen eine ernste Belastung für das globale Gesundheitssystem. Durch eine weite Verbreitung in der Bevölkerung und einen hohen Anteil resistenter Stämme ist Staphylococcus aureus dabei einer der relevantesten Erreger. Zudem führt S. aureus zu einer Vielzahl möglicher Infektionserkrankungen von Hautentzündungen bis hin zu Sepsis oder chronischen Erkrankungen. Entsprechend sind neue therapeutische Ansätze zur Bekämpfung von S. aureus von hohem Interesse. Zur Entwicklung neuer Therapien ist das Verständnis der Virulenzmechanismen von zentraler Bedeutung. In vitro Methoden können dabei nur einen geringen Teil der im Wirt vorliegenden Komplexität abdecken. Tiermodelle sind daher ein wichtiger Bestandteil der Infektionsforschung. Wie für viele bakterielle Erreger ist das Mausmodell für S. aureus das wichtigste Tiermodell. Allerdings zeigt die bisher meist übliche Kombination aus einem klinischen S. aureus Isolat und der Maus als Infektionswirt teils deutlich von der klinischen Situation abweichende Infektionsverläufe. Eine vielversprechende Alternative zur Verbesserung des Mausmodells stellen Maus-angepasste S. aureus Stämme dar, die in den letzten Jahren bereits vermehrt erfolgreich eingesetzt wurden. Einer der am häufigsten genutzten, Maus-angepassten Stämme ist JSNZ, der aus entzündeten Präputialdrüsen von C57BL/6 Mäusen isoliert wurde. JSNZ ermöglicht eine chronische Kolonisierung sowie akute Infektionen in Mäusen. Zudem ist der Stamm gut transformierbar, was molekulare Untersuchungen begünstigt. Diese Doktorarbeit befasst sich mit der Charakterisierung von JSNZ als Referenzstamm für Maus-angepasste S. aureus Stämme in der Infektionsforschung. Dabei wurde die Genomsequenz von JSNZ vervollständigt und mit funktionellen Annotationen auf AureoWiki zur Verfügung gestellt. Zudem wurde das Proteom des Stammes unter Standardlaborbedingungen aufgenommen und analysiert. Dabei fiel vor allem die extrem hohe Menge der Serinprotease Jep (JSNZ extracellular protease) im Überstand auf. In der stationären Wachstumsphase im Vollmedium TSB entfallen rund 74% der Gesamtproteinmenge nur auf dieses eine Protein. Aus der Literatur ist zudem bekannt, dass jep nahezu ausschließlich in Maus-angepassten S. aureus Isolaten auftritt. Entsprechend befassten sich weitere Untersuchungen dieser Doktorarbeit insbesondere mit Jep. In erster Linie wurde das Plasmidsystem pTripleTREP zur homologen Expression und schnellen Aufreinigung von Jep und anderen sekretierten Virulenzfaktoren in S. aureus etabliert. pTripleTREP verfügt über einen neu konstruierten Anhydrotetracyclin-induzierbaren Promotor, der unter nicht induzierten Bedingungen die Expression vollständig unterdrückt. Zudem können sekretierte Zielproteine über einen hochaffinen Twin-Strep-Tag direkt aus dem Kulturüberstand aufgereinigt werden. In nur einem Aufreinigungsschritt wurden reine und aktive S. aureus Proteasen gewonnen, die zur weiteren Charakterisierung eingesetzt wurden. Darunter auch Ansätze der N-Terminomik zur Identifizierung potentieller Jep-Substrate. Die Ergebnisse weisen auf eine proteolytische Prozessierung von S. aureus-eigenen Virulenzfaktoren und mithin eine Balancierung der Virulenzausprägung durch Jep hin. Neben der Überexpression und Aufreinigung von Proteinen wurden im Rahmen dieser Doktorarbeit weitere Anwendungsmöglichkeiten von pTripleTREP und verwandten Plasmidsystemen zur Untersuchung der Bakterienphysiologie gezeigt. Dazu zählen konditionelle Komplementationen von Genen mit adjustierbaren Expressionsniveaus und Untersuchungen von Promotoren durch Fluoreszenzreporter. Während die letztgenannte Funktionalität in Bacillus subtilis eingeführt wurde, soll eine auf S. aureus adaptierte Variante des Plasmids in weiterführenden Studien zur Untersuchung der transkriptionellen Regulation von jep Anwendung finden. Zusammengefasst wurden im Rahmen dieser Doktorarbeit grundlegende Ressourcen zur Etablierung von JSNZ als Referenzstamm für Maus-angepasste S. aureus in der Infektionsforschung geschaffen. Dazu zählen neben der vollständigen Genomsequenz und dem Proteomprofil unter Laborbedingungen auch molekulare Werkzeuge. Diese dienen zur weiteren Untersuchung einzelner Virulenzfaktoren wie auch zur Aufklärung der Bakterienphysiologie. Die Ergebnisse legen nahe, dass Jep eine wichtige Funktion in JSNZ innehat. Daraus ergibt sich ein dringender Bedarf, die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen aufzuklären, um deren Bedeutung im Rahmen der Verwendung des Stammes in Mausmodellen einschätzen zu können.