Larissa Busch

• In the presented cumulative PhD thesis, the interplay of the protein homeostasis and pathophysiology of the Gram-positive opportunistic pathogen Staphyloccoccus aureus was investigated. Since proteins are the main players of life their synthesis, modification, localization and finally degradation need to be precisely balanced and regulated, which is meant by the term protein homeostasis. As an opportunistic pathogen, S. aureus uses complex regulatory mechanisms to also regulate virulence and fitness in order to adapt optimally to the host. In addition, protein homeostasis and pathophysiology also influence each other as, for example, imbalances of the protein homeostasis lower the bacterial fitness and specific players of the protein homeostasis modulate virulence factor levels. Conversely, adaptations to infection-relevant stress conditions obviously lead to a modulation of the proteome, since, for example, the synthesis of specific proteins is influenced with regard to stress adaptation. In the here presented thesis, for the aspect of protein homeostasis, the focus was on the role of the Clp-ATPase ClpX, which is part of the Clp protease and chaperone system, and the hibernation factor SaHPF, which is required for formation of the 100S hibernating ribosomes. The Clp system is of pivotal role in S. aureus and other Gram-positive organisms for the general and specific proteolysis and it is required for specific and general stress responses. ClpX in interaction with the peptidase subunit ClpP can form the ClpXP protease, however it also acts as a chaperone on its own. 100S ribosomes are an option to inhibit translation under stress condition as dimerization of 70S ribosomes reduces the amount of available active translation machineries of the cell. In context of S. aureus pathophysiology, the iron-regulated sRNA IsrR was investigated. IsrR mediates a so-called iron sparing response and represents an additional regulatory level to the master regulator Fur (ferric uptake regulator) of the iron limitation response. The global iron limitation response is of particular importance in infections, as the available iron in the host environment is reduced in the process of nutritional immunity. This resulted in a total of six manuscripts addressing the questions: 1. How does ClpX interact with infection-relevant stress responses on a global proteomic scale in S. aureus? ClpX is involved in several adaptations to infection-related stresses such as the iron limitation response, the oxygen limitation response and the response to oxidative stress. The presented study provides a comprehensive global proteomic dissection using in particular statistical component analyses to elucidate the role of ClpX in multiple aspects of the S. aureus pathophysiology. Known effects of ClpX on the physiology of S. aureus were largely confirmed. In addition, the role of ClpX as a positive regulatory element for the iron limitation response and the oxygen limitation response could be demonstrated. ClpX’s role in virulence was highlighted in two infection models, in vivo in Galleria mellonella and in vitro in 16HBE14o- cells. It was hypothesized that reduced ClpX abundance may be involved in the formation of intracellular persister cells. 2. Is maintaining appropriate levels of the peptidoglycan hydrolase CxcA by ClpXP and an sRNA involved in proper temperature-dependent daughter cell splitting in S. aureus cells? The previously poorly described peptidoglycan hydrolase CxcA was described as a novel ClpXP protease target. CxcA is critical for the coordination of daughter cell splitting of dividing S. aureus especially at lower temperatures. Protein levels of CxcA are regulated by ClpXP together with the sRNA Rbc1. This underlines the importance of the Clp system to fundamental biological mechanisms such as daughter cell splitting in S. aureus. 3. Is the function of ClpX in the Gram-positive pathogen Streptococcus pneumoniae the same as in S. aureus? In contrast to S. aureus, in S. pneumoniae ClpX as a chaperone is essential, however the ClpXP protease is not. With regard to virulence, cell wall homeostasis, autolysin accumulation and cell division the phenotype of ClpX-deficient S. pneumoniae strains resembles ClpX-deficient S. aureus strains. 4. How does the lack of SaHPF and its regulators SigB and CodY effect the intracellular survival and virulence of S. aureus? S. aureus lacking SaHPF are more frequently internalized but show less cytotoxicity towards A549 host cells. CodY (regulator of the amino acid metabolism)-lacking S. aureus also showed reduced cytotoxicity. Interestingly, the absence of SaHPF and CodY led to impaired septum formation and altered sensitivity to cell wall-active antibiotics, indicating a disturbance in cell division. With regard to virulence factor production, lack of the general stress regulator SigB and CodY had more pronounced effects than absence of SaHPF. 5. What is the global targetome of IsrR and does IsrR mediate an “iron-sparing response” in S. aureus? By combination of two proteomic experiments to identify proteins which were altered in abundance by IsrR presence or absence and the further combination with in silico predictions of IsrR binding sites, the IsrR targetome was characterized. We identified 21 targets, which included several Fe-S cluster or heme-containing proteins as well as proteins involved in heme biosynthesis. Furthermore, multiple proteins of the tricarboxylic acid cycle and oxidative stress resistance proteins were identified as targets. The study confirmed the assumption that IsrR mediates the iron-saving response of S. aureus. 6. Is IsrR involved in regulation of virulence factors in S. aureus? In addition to IsrR’s role in regulation of the central metabolism, it also positively affects protein levels of several secreted virulence factors, such as α-hemolysin. A global secretome analysis revealed that IsrR positively affects the protein levels of SaeR regulon members and thus IsrR is involved in SaeRS activation. In addition, the protein abundances of heme uptake and siderophore-mediated iron uptake systems were increased in the presence of IsrR. Thus, IsrR represents a link between the iron limitation response and the virulence network of S. aureus. In conclusion, multiple connections between the protein homeostasis and pathophysiology of S. aureus were revealed by the results presented here. To dissect the interplay of such aspects, global proteome analyses in combination with molecular biological experiments and infection models as well as dedicated in silico analysis were performed. The here provided global analyses will serve as important resources and as starting points for more detailed molecular studies of selected aspects of each of the projects.
• In der vorliegenden kumulativen Dissertation wurde das Zusammenspiel von Proteinhomöostase und Pathophysiologie des Gram-positiven opportunistischen Erregers Staphyloccoccus aureus untersucht. Da Proteine die Hauptakteure des Lebens sind, müssen ihre Synthese, Modifikation, Lokalisierung und schließlich ihr Abbau exakt reguliert werden. Diese Prozesse können unter dem Begriff Proteinhomöostase zusammengefasst werden. Als opportunistischer Krankheiterreger kontrolliert S. aureus mittels komplexer Regulationsmechanismen das Gleichgewicht zwischen Virulenz und Fitness, um sich optimal an den Wirt anzupassen. Dabei beeinflussen sich Proteinhomöostase und Pathophysiologie gegenseitig. Ungleichgewichte in der Proteinhomöostase reduzieren beispielsweise die bakterielle Fitness und spezifische Akteure der Proteinhomöostase modulieren die Abundanz von Virulenzfaktoren. Dagegen führen offensichtlich Anpassungen an infektionsrelevante Stressbedingungen zu einer Modulation des Proteoms, da z. B. die Synthese spezifischer Proteine im Hinblick auf die Stressanpassung beeinflusst wird. In der hier vorgestellten Arbeit wurde für den Aspekt der Proteinhomöostase im Speziellen die Rolle der Clp-ATPase ClpX, die Teil des Clp-Protease- und Chaperonsystems ist, und des hibernations factor SaHPF, der für die Bildung der 100S-Ribosomen erforderlich ist, beleuchtet. Das Clp-System spielt in S. aureus und anderen Gram-positiven Organismen eine zentrale Rolle für die allgemeine und spezifische Proteolyse und ist an der Anpassung an verschiedene Stressbedingungen beteiligt. ClpX kann in Wechselwirkung mit der Peptidase-Untereinheit ClpP die ClpXP-Protease bilden, es kann aber auch allein als Chaperon agieren. 100S-Ribosomen sind eine Strategie, um die Translation unter Stressbedingungen zu hemmen, da durch Dimerisierung von 70S-Ribosomen die Menge der verfügbaren aktiven Translationsmaschinen der Zelle verringert wird. Im Kontext der Pathophysiologie von S. aureus wurde außerdem die eisenregulierte sRNA IsrR untersucht. IsrR vermittelt eine sogenannte Eisensparantwort und stellt eine zusätzliche regulatorische Ebene zum Hauptregulator der Eisenlimitationsantwort, Fur (ferric uptake regulator) dar. Die globale Eisenlimitationsantwort ist bei Infektionen von besonderer Bedeutung, da im Prozess der nutritional immunity das verfügbare Eisen in der Wirtsumgebung verringert wird. Im Rahmen dieser Arbeit entstanden sechs Manuskripte, die sich mit den folgenden Fragen befassten: 1. Wie interagiert ClpX auf Proteomebene mit infektionsrelevanten Stressantworten in S. aureus? ClpX ist an mehreren Anpassungen auf infektionsrelevanten Stresse wie der Eisenlimitationsantwort, der Sauerstofflimitationsantwort und der Antwort auf oxidativen Stress beteiligt. Die Studie stellt eine umfassende Proteomanalyse insbesondere unter Verwendung von Komponentenanalysen dar, um die Rolle von ClpX in ausgewählten Aspekten der Pathophysiologie von S. aureus aufzuklären. Bekannte Effekte von ClpX auf die Physiologie von S. aureus konnten weitestgehend bestätigt werden. Zusätzlich konnte die Rolle von ClpX als positives regulatorisches Element für die Eisenlimitationsantwort und die Sauerstofflimitationsantwort gezeigt werden. Die Rolle von ClpX bei der Virulenz wurde in zwei Infektionsmodellen, in vivo in Galleria mellonella und in vitro in 16HBE14o- Zellen, nachgewiesen. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass eine reduzierte ClpX-Abundanz an der Bildung intrazellulärer Persisterzellen beteiligt sein könnte. 2. Ist die Kontrolle der Proteinmenge der Peptidoglykan-Hydrolase CxcA durch ClpXP und eine sRNA an der temperaturabhängigen koordinierten Abspaltung von Tochterzellen von S. aureus beteiligt? Die bisher nur wenig beschriebene Peptidoglykan-Hydrolase CxcA wurde als neues ClpXP-Protease-Substrat identifiziert. CxcA ist insbesondere bei niedrigen Temperaturen entscheidend für die Koordination der Trennung der Tochterzellen der sich teilenden S. aureus-Zellen. Die Proteinabundanz von CxcA wird durch ClpXP im Zusammenspiel mit der sRNA Rbc1 gesteuert. Dies unterstreicht die Bedeutung des Clp-Systems für grundlegende biologische Mechanismen wie der Zellteilung in S. aureus. 3. Ist die Funktion von ClpX im Gram-positiven Erreger Streptococcus pneumoniae vergleichbar mit der in S. aureus? Im Gegensatz zu S. aureus ist bei S. pneumoniae die Chaperonfunktion von ClpX essentiell, die Protease ClpXP jedoch nicht. In Bezug auf Virulenz, Zellwandhomöostase, Autolysinakkumulation und Zellteilung ähnelt der Phänotyp von ClpX-defizienten S. pneumoniae-Stämmen dem von ClpX-defizienten S. aureus-Stämmen. 4. Wie wirkt sich das Fehlen des hibernation factor SaHPF und seiner Regulatoren SigB und CodY auf das intrazelluläre Überleben und die Virulenz von S. aureus aus? In der Studie, konnte gezeigt werden, dass S. aureus-Zellen, denen SaHPF fehlt, häufiger internalisiert werden, aber eine geringere Zytotoxizität gegenüber A549-Wirtszellen aufweisen. S. aureus-Zellen, denen der Regulator CodY, der u.a. den Aminosäurenmetabolismus kontrolliert, fehlt, zeigen ebenfalls eine geringere Zytotoxizität. Zudem führte das Fehlen von SaHPF und CodY zu einer beeinträchtigten Septumbildung und eine veränderte Empfindlichkeit gegenüber zellwandaktiven Antibiotika, was auf eine Störung der Zellteilung hindeutet. Im Hinblick auf die Produktion von Virulenzfaktoren hatte das Fehlen von des generellen Stressregulators SigB und CodY stärkere Auswirkungen als das Fehlen von SaHPF. 5. Wie sieht das globale Targetom von IsrR aus und vermittelt IsrR eine Eisensparantwort in S. aureus? Durch die Kombination von zwei Proteom-Experimenten zur Identifizierung von Proteinen, deren Abundanz durch das Vorhandensein von IsrR verändert wird, mit einer In-silico-Vorhersage von IsrR-Bindungsstellen wurde das IsrR-Targetom charakterisiert. Zu den 21 identifizierten Targets gehörten mehrere Fe-S-Cluster- oder hämhaltige Proteine sowie Proteine, die an der Häm-Biosynthese beteiligt sind. Außerdem wurden mehrere Proteine des Tricarbonsäurezyklus und Proteine der oxidativen Stressantwort, als Targets identifiziert. Mit der Studie konnte die Annahme bestätigt werden, dass IsrR die Eisensparantwort von S. aureus vermittelt. 6. Ist IsrR an der Regulation von Virulenzfaktoren in S. aureus beteiligt? Neben der Funktion von IsrR bei der Regulation des zentralen Stoffwechsels wird auch die Menge mehrerer sekretierter Virulenzfaktoren, wie z.B. α-Hämolysin, positiv durch IsrR kontrolliert. Eine globale Sekretomanalyse hat gezeigt, dass IsrR insbesondere die Abundanz von Proteinen beeinflusst, die zum SaeR-Regulons gehören und, dass IsrR an der Aktivierung des SaeRS-Zwei-Komponentensystems beteiligt ist. Darüber hinaus waren die Proteinabundanzen von Systemen der Häm-Aufnahme und der Siderophor-vermittelten Eisenaufnahme bei Anwesenheit von IsrR erhöht. Damit stellt IsrR ein Bindeglied zwischen der Eisenlimitationsantwort und dem Virulenznetzwerk von S. aureus dar. Zusammenfassend wurde die Vernetzung der Proteinhomöostase und der Pathophysiologie in S. aureus anhand der hier dargestellten Ergebnisse gezeigt. Um das Zusammenspiel dieser beiden Aspekte zu untersuchen, wurden globale Proteomanalysen in Kombination mit molekularbiologischen Experimenten und Infektionsmodellen sowie speziellen in silico-Analysen durchgeführt. Die hier vorgelegten globalen Analysen werden als wichtige Ressourcen sowie als Ausgangspunkte für detailliertere molekulare Untersuchungen ausgewählter Aspekte der einzelnen Projekte dienen.