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Depletion von Heat Shock Protein 70 (HSP70) induziert Apoptose in Pankreaskarzinomzellen

  • Das Pankreaskarzinom zeichnet sich durch ein aggressives Tumorwachstum verbunden mit einer sehr geringen 5-Jahres-Überlebensrate und einem schlechten Ansprechen auf eine zytostatische Therpie aus. Eines der Merkmale von Tumorzellen ist ihre Resistenz gegenüber Apoptose. Heat Shock Proteine (HSPs) bilden eine große homologe Proteingruppe, die nicht nur zytoprotektive Funktionen haben, sondern auch in malignen Tumorzellen überexprimiert werden und die apoptotische Kaskade an mehreren Stellen hemmen können. In dieser Arbeit untersuchten wir, ob Heat Shock Proteine auch im Pankreaskarzinom überexprimiert sind und welchen Einfluss HSP70 auf die Apoptose in Pankreaskarzinomzellen hat. Die humanen duktalen Adenokarzinomzelllinien Panc-1, MIA PaCa-2, BxPC-3 und Capan-2 sowie nicht-transformierte duktale Pankreaszellen wurden hierfür verwendet. Mittels Western Blot und Immunzytochemie wurde die Expression von HSP70 detektiert, die Bestimmung der Zellproliferation erfolgte durch eine kolorimetrische Messung. Zur Inhibition von HSP70 wurden sowohl Quercetin, ein pflanzliches Polyphenol, als auch HSP70 spezifische siRNA verwendet. Die Apoptose wurde durch Messung der Caspasen-3 und -9, der Bestimmung des Anteils Annexin-V positiver Zellen in der Durchflusszytometrie und in situ durch TUNEL-Färbungen untersucht. Wir konnten nachweisen, dass HSP70 trotz identischer Kultivierungsbedingungen in Tumorzellen stärker exprimiert wird als in den duktalen Zellen. Thermischer Stress konnte die HSP70 Expression weiter steigern. Durch Quercetin gelang eine Inhibition der HSP70 Expression, die zu einer verrringerten Zellproliferation von Tumorzellen führte, nicht jedoch von normalen duktalen Zellen, die nur wenig HSP70 exprimierten. Dihydroquercetin, ein ineffektives Analogon von Quercetin ohne HSP70 reduzierende Eigenschaften, hatte weder in Tumorzellen noch in normalen pankreatischen duktalen Zellen eine Wirkung. In den Karzinomzelllinien Panc-1 und MIA PaCa-2 führte der Verlust von HSP70 durch Quercetin zu einer gesteigerten Apoptose, wie durch Caspase-3 und -9 Messung, Annexin-V Markierung und im TUNEL-Assay gezeigt wurde, während Dihydroquercetin in keiner der untersuchten Zelllinie Apoptose auslöste. Diese Ergebnisse konnten unter Verwendung von HSP70 spezifischer siRNA bestätigt werden. Nach 48 bzw. 72 Stunden wurde HSP70 in Panc-1 und MIA PaCa-2 fast vollständig inhibiert und eine gesteigerte Apoptoserate gemessen. Kontrollexperimente mit nicht-spezifischer „scrambled“ siRNA konnten keine Induktion der Apoptose nachweisen. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die Anwesenheit von Heat Shock Protein 70 die erhöhte Apoptoseresistenz von Pankreaskarzinomzellen miterklärt. Depletion von HSP70 leitet die Apoptose in pankreatischen Tumorzellen ein. Um mögliche andere pro-apoptotische Effekte von Bioflavonoiden zu umgehen, verwendeten wir RNA Interferenz, die ein gezieltes Ausschalten eines einzelnen Gens gewährleistet. Damit konnten wir unsere vorher mit Quercetin erzielten Ergebnisse bestätigen. Wir konnten zeigen, dass HSP70 anti-apoptotische Eigenschaften im Pankreaskarzinom hat, HSP70 inhibierende Substanzen könnten daher ein therapeutisches Potential in der Behandlung des Pankreaskarzinoms haben.
  • Pancreatic carcinoma is characterized by aggressive tumour spread and a poor response to chemotherapy. One of the underlying mechanisms of tumour cells is their resistance to apoptosis. Heat shock proteins (HSPs) are highly conserved proteins that have not only cytoprotective functions but can also interfere with the apoptotic cascade. In this study we investigated the role of heat shock protein 70 in apoptosis of pancreatic cancer. HSP70 expression was determined by Western blotting and immunocytochemistry in the pancreatic cancer cell lines Panc-1, MIA PaCa-2, BxPC-3 and Capan-2 as well as in non-transformed pancreatic ductal cells. Cell proliferation was assessed using a colourmetric assay. HSP70 was inhibited by using the bioflavonoid quercetin or by RNA interference. Apoptosis was assessed by measurement of caspase-3 and -9 activity, determination of annexin-V positive cells by flow-cytometry and in-situ by TUNEL-assay. We could demonstrate that HSP70 expression is increased in tumour cells compared to normal ductal cells. Thermic stress could even enhance HSP70 synthesis. Depletion of HSP70 by quercetin decreased cell viability in cancer cells but not in non-transformed ductal cells. In Panc-1 and MIA PaCa-2 cells depletion of HSP70 by quercetin increased apoptosis shown by caspase-3 and -9 activation, annexin-V labelling and TUNEL-assay. We could confirm our results by using HSP70 specific siRNA. Control experiments using non-specific “scrambled” siRNA did not show any induction of apoptosis. These findings indicate that presence of heat shock protein 70 contributes to the resistance of apoptosis in pancreatic cancer cells and that its inhibition increases apoptosis. Therefore HSP70 inhibitors might have a therapeutic potential for the treatment of pancreatic cancer

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Metadaten
Author: Ali Aghdassi
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000471-6
Title Additional (English):Depletion of Heat Shock Protein 70 (HSP70) induces Apoptosis in Pancreatic Cancer Cells
Advisor:Prof. Dr. Markus M. Lerch
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2008/03/17
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Medizinische Fakultät (bis 2010)
Date of final exam:2008/03/05
Release Date:2008/03/17
GND Keyword:Apoptose, Heat Shock Protein 70, Pankreaskarzinom
Faculties:Universitätsmedizin / Klinik und Poliklinik für Innere Medizin Abt. Gastroenterologie, Endokrinologie und Ernährungsmedizin
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit