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Die Rolle der CD4+ T-Lymphozyten bei Sepsis - Untersuchungen in einem Peritonitismodell der Maus

  • Generalisierte bakterielle Infektionen, auch Sepsis genannt, sind trotz intensivmedizinischer Behandlung mit einer sehr hohen Letalität verbunden. Um kausale Therapiestrategien zu entwickeln, ist ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden Pathomechanismen, insbesondere der Reaktionen des Immunsystems, notwendig. Da die Sepsis ein hoch komplexer Vorgang ist, an dem der gesamte Organismus beteiligt ist, sind grundlegende Untersuchungen im Tiermodell dafür unverzichtbar. Nach aktuellen Modellvorstellungen verläuft die Immunreaktion bei einer Sepsis typischerweise in zwei Phasen: Auf eine überschießenden Entzündungsantwort folgt eine Phase der generalisierten Immunparalyse. Die Rolle des angeborenen Immunsystems bei diesen Reaktionen ist gut dokumentiert, jene des adaptiven Immunsystems in der Pathogenese der Sepsis ist dagegen wenig untersucht. Ihr wurde zwar eine wichtige Rolle in der späten Phase zugesprochen, denn die Lymphozytenapoptose trägt zur Entstehung einer Immunparalyse bei. Da adaptive Immunreaktionen jedoch einige Zeit in Anspruch nehmen, wurde eine wichtige Rolle in der frühen Phase des hoch akuten Krankheitsbildes Sepsis für unwahrscheinlich gehalten und deshalb bisher kaum betrachtet. Wir hatten jedoch aus Vorversuchen Hinweise auf eine sehr schnelle T-Zellbeteiligung bei der Sepsis. Deshalb lag der Schwerpunkt dieser Arbeit auf der Aufklärung der Rolle von CD4+ T-Lymphozyten bei Sepsis. Diese wurde in einem etablierten Sepsismodell der Maus untersucht, der Colon ascendens Stent-Peritonitis (CASP). Das Modell wurde entwickelt, um die klinische Situation von Patienten, bei denen es aufgrund der Insuffizienz einer chirurgischen Naht im Magen-Darm-Trakt zur Entwicklung einer diffusen Peritonitis kommt, möglichst genau abzubilden. Überraschend beobachteten wir bei CASP innerhalb weniger Stunden eine starke Induktion der Expression von CTLA-4 (cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4) auf den CD4+ T-Lymphozyten. Die Expression dieses Moleküls wird nach der Aktivierung von T-Zellen induziert. Dies lässt auf eine Beteiligung der CD4+ T-Zellen in einem frühen Stadium der Erkrankung schließen. Eine Depletion der CD4+ T-Zellen im Vorfeld der CASP-Operation mit dem monoklonalen Antikörper GK1.5 führte zu einer effektiveren Beseitigung der Bakterien aus dem Peritoneum, zu einer geringeren systemischen Verbreitung der Erreger und zu einem deutlich verbesserten Überleben der Tiere. Damit verbunden war eine verstärkte Einwanderung von Zellen des angeborenen Immunsystems in das Peritoneum. Dies impliziert, dass bei einer systemischen Dissemination kommensaler Bakterien die CD4+ T-Zellen die lokale Reaktion des angeborenen Immunsystems inhibieren, in diesem Tiermodell mit lebensbedrohlichen Konsequenzen. Die Blockade der T-Zellrezeptorvermittelten Signalgebung durch Tacrolimus (FK506) hatte dagegen keinen Einfluss auf das Überleben der Peritonitis. Dies zeigt, dass die Effekte der CD4+ T-Zellen zumindest teilweise unabhängig von der T-Zellrezeptorvermittelten Antigenerkennung sein müssen. Eine Blockade von des inhibititorischen T-Zelloberflächenmoleküls CTLA-4 bewirkte eine starke Induktion von ICOS (inducible co-stimulator) sowie eine deutliche Inhibition der Sekretion von IL-10. Die verstärkte T-Zellaktivierung und Hyperinflammation ging einher mit einem Überlebensnachteil. Zur Untersuchung der Langzeitkonsequenzen, die eine Sepsis nach sich zieht, wurden die Tiere bis zu drei Monate nach der Operation untersucht. Die Peritonitis war mit massivem Zelltod in Thymus, Milz und mesenterialen Lymphknoten assoziiert, jedoch mit unterschiedlicher Kinetik. Die systemische Infektion führte innerhalb kurzer Zeit zu einem fast vollständigen Verlust des Thymus, doch 14 Tage nach der Operation war das Organ wieder unauffällig. In der Milz hingegen setzte die Apoptose später ein und war nicht so ausgeprägt, hielt aber länger an. Eine sich anschließende Hyperplasie der Milz war drei Monate nach Induktion der Peritonitis am stärksten und ein Zeichen für eine noch nicht abgeschlossene Immunreaktion. Neben der Aktivierung von T-Zellen in der frühen Phase der Erkrankung wurde auch etwa eine Woche nach der Operation eine Reaktion von T-Zellen anhand der Änderung von Oberflächenmolekülen und der Sekretion von Zytokinen beobachtet. Diese Aktivierung erfolgte aufgrund der Kinetik vermutlich auf dem „klassischen“ Weg. Das Muster der Zytokinausschüttung lässt vermuten, dass nach CASP eine Th1-Antwort überwiegt. Ein weiteres wichtiges Ergebnis dieser Dissertation ist, dass nach diffuser Peritonitis ein Immungedächtnis aufgebaut wird. Es entwickelten sich funktionsfähige Keimzentren, und im Serum ließen sich ungewöhnlich hohe Konzentrationen von Antikörpern der Klassen IgM und IgG messen. Die Bildung von T-Gedächtniszellen ging damit einher. Erste Immunisierungsversuche mit TNP-KLH zu verschiedenen Zeitpunkten vor oder nach CASP deuten darauf hin, dass die Peritonitis weder die Entwicklung einer primären Immunantwort verhinderte noch ein bereits etabliertes Immungedächtnis störte. Im multifaktoriellen Prozess einer Sepsis spielen folglich auch die T-Lymphozyten eine wichtige Rolle. Dies sollte bei der Entwicklung neuer Therapiestrategien berücksichtigt werden. Dabei ist jedoch zu beachten, dass die Population der CD4+ T-Lymphozyten sehr heterogen ist und verschiedene Funktionen bei der Abwehr bakterieller Infektionen ausübt. Deshalb ist die Elimination der Gesamtheit der CD4+ T-Zellen höchstwahrscheinlich keine Behandlungsoption bei der Sepsis, obwohl sie in dieser Arbeit beim Tiermodell einen deutlichen Überlebensvorteil bewirkte. Es ist jetzt notwendig, die Funktionen der verschiedenen T-Zellsubpopulationen bei generalisierten bakteriellen Infektionen im Detail zu untersuchen. Die Herausforderung liegt in der Identifikation von wichtigen Kontrollpunkten der T-Zellen, die therapeutischen Eingriffen zugänglich sind. Bei diesen Interventionen muss die Gefahr einer starken Dysbalance des Immunsystems vermieden werden. Es ist ebenso wichtig zu beachten, dass die Reaktion des Immunsystems nicht nach der akuten Phase einer Sepsis endet, sondern Monate - möglicherweise sogar Jahre - danach andauert, wie in dieser Arbeit gezeigt wird. Dies könnte erklären, warum sich bei Patienten, die diese Erkrankung überlebt haben, bis zu fünf Jahren später eine signifikant erhöhte Mortalität epidemiologisch nachweisen lässt. Eine besseres Verständnis der immunologischen Langzeitkonsequenzen einer Sepsis ist die Voraussetzung für die Entwicklung therapeutischer Strategien zur Senkung der Mortalität bei Überlebenden dieser schweren Erkrankung. In einer prospektiven klinischen Pilotstudie sollte überprüft werden, ob die aus den tierexperimentellen Versuchen gewonnenen Befunde auch für den Menschen Relevanz haben könnten. Hierzu wurde die Expression von CTLA-4 als Parameter einer Beteiligung von T-Zellen bei Patienten untersucht, die sich einem großen abdominalchirurgischen Eingriff unterzogen, welcher mit einem hohen Risiko für die Entwicklung einer Sepsis verbunden war. Bei allen Patienten zeigten sich eine teilweise dramatische Abnahme der CD3+ T- Zellen, bei dem überwiegenden Teil der Patienten war ein Anstieg der Expression von CTLA-4 zu beobachten. Mit der Induktion des Moleküls einhergehend waren Änderungen der klinischen Parameter, der Zusammensetzung der T-Zellpopulationen und deren Aktivierungszustand, so dass die Bestimmung der Expression von CTLA-4 für die Beurteilung des Immunstatus der Patienten nützlich sein könnte. Da die Messung jedoch sehr aufwändig, zeitintensiv und schwer standardisierbar ist, erscheint sie aktuell ungeeignet für die Routinediagnostik.
  • Abdominal sepsis and septic shock are leading causes of death in intensive care units. The role of T cells in these generalized bacterial infections is still under debate. To address this, we have used CASP (colon ascendens stent peritonitis) as a murine model of polymicrobial sepsis: Implantation of a stent of defined diameter into the colon ascendens wall leads to the continuous efflux of gut bacteria into the peritoneal cavity and results in systemic inflammation. Contrary to textbook knowledge, we found strong upregulation of CTLA-4 (CD152) expression by CD4+ T cells already within 12 hours after CASP. CTLA-4, which shows sequence homology to CD28, is constitutively expressed on CD4+CD25+ T regulatory cells (Treg) and generally upregulated on T cells after activation. The aim of the first part of this thesis was to elucidate the role of T cells. We performed the following experiments: (1) Depletion of the CD4+ T cells with a monoclonal antibody improved local bacterial clearance from the peritoneal cavity, reduced bacterial dissemination and resulted in better survival of the septic mice. This was accompanied by substantially increased immigration of granulocytes and macrophages into the peritoneal cavity indicating that CD4+ T cells inhibit the local innate immune response. (2) Blockade of CTLA-4 with a monoclonal antibody caused an overwhelming systemic activation of T lymphocytes in conjunction with a suppression of systemic IL-10 release, which led to higher mortality within the first 72 hours. This underlines that the control of early T cell activation is crucially important in bacterial sepsis. (3) Blockade of TCR signaling by tacrolimus did not influence the survival of septic mice, showing that the effects of the CD4+ T lymphocytes were independent of TCR-mediated antigen recognition. We conclude that in diffuse peritonitis caused by commensal gut bacteria the CD4+ T lymphocytes exert a net negative effect on the local anti-bacterial defense and thereby contribute to bacterial dissemination and poor outcome. The second part of the thesis addresses the long-term consequences of sepsis. For this mice were investigated up until three months after surgery. We found that apoptosis was induced rapidly after surgery in thymus and other lymphoid organs and went on for several days. The spleen showed a massive hyperplasia three months after surgery. The T cell activation was biphasic. Following their rapid reaction within hours, which has been described, a second wave of T lymphocyte activation was observed seven days after surgery. This was accompanied by changes in the expression of cell surface markers and by the secretion of cytokines. The released cytokines indicated the dominance of a Th1 profile after CASP. We also determined the development of immunological memory after diffuse peritonitis. We observed the formation of germinal centres and measured unusual high serum concentrations of IgM and IgG. The development of the phenotype of T memory cells went along with this. In the attachment, finally, we describe the results of a prospective clinical trial, in which we measured the expression of CTLA-4 as a marker for T cell activation on peripheral blood cells of patients who underwent an abdominal surgery, associated with a high risk to develop complications such as sepsis. All patients showed a dramatic reduction in the number of CD3+ T cells and most experienced a strong increase in CTLA-4 expression, indicating that in the human T cells take part in the immune response to abdominal surgery with or without subsequent infection.

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Metadaten
Author: Mandy Busse
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000454-1
Title Additional (English):The role of CD4+ T lymphocytes in sepsis - investigations in a murine peritonitis model
Advisor:Prof. Dr. Barbara Bröker
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2008/04/24
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2007/12/14
Release Date:2008/04/24
Tag:Apoptose, Immunsuppression, T-Zellen, bakterielle Infektion
GND Keyword:Peritonitis, Sepsis
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Immunologie u. Transfusionsmedizin - Abteilung Immunologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 500 Naturwissenschaften