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Funktionelle Charakterisierung des essentiellen Tegumentproteins pUL36 des Pseudorabies Virus

  • Das Pseudorabies Virus ist der Erreger der Aujeszkyschen Erkrankung, einer fieberhaften Allgemeinerkrankung mit neurologischen Symptomen beim Schwein. Aufgrund seiner biologischen Eigenschaften und unkomplizierten Kultivierung in Zellkultur sowie der Verfügbarkeit eines Mausmodells hat sich PrV als geeignetes Modellsystem zur Untersuchung der alphaherpesviralen Replikation etabliert. Das Tegument stellt den komplexesten und noch am wenigsten verstandenen Teil des Herpesviruspartikels dar. Für PrV konnten mehr als 15 dem Tegument zugeordnete Proteine identifiziert werden, die neben ihrer strukturellen Bedeutung auch regulatorische Funktionen erfüllen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung und Charakterisierung funktioneller Domänen des essentiellen Tegumentproteins pUL36 des Pseudorabies Virus. Mit Hilfe eines Transkomplementationsassays konnten verschiedene rekombinante UL36-Proteine auf ihre Fähigkeit, den letalen Replikationsdefekt einer UL36-Deletionsmutante zu komplementieren, überprüft werden. Bei positiver Komplementation wurden stabile Virusrekombinanten isoliert und diese auf ein möglicherweise verändertes Replikationsverhalten in der Zellkultur (in vitro) oder im Mausmodell (in vivo) untersucht. Negative Komplementationsergebnisse weisen auf eine essentielle Funktion dieser Region innerhalb des UL36-Proteins hin. Die durchgeführten Primärsequenzvergleiche homologer UL36-Proteine zeigten einen geringen Grad an Sequenzhomologie. Jedoch konnten mehrere konservierte Domänen und putative Motive identifiziert werden. Dem im N-Terminus gelegenen Modul konnte die für HSV-1 sowie Vertretern aller drei Unterfamilien beschriebene Deubiquitinylierungsaktivität zugeordnet werden. Weiterhin zeigte sich, dass die 62 C-terminalen Aminosäuren innerhalb der Alphaherpesviren stark konserviert sind, was auf eine wichtige Bedeutung dieser Region für die Funktion des UL36-Proteins hindeutet. Eine große prolinreiche Domäne im C-terminalen Bereich spricht für eine extreme Flexibilität des Proteins und eine mögliche Konformationsänderung während des Replikationszykluses. Leucin-Zipper-Motive könnten eine pUL36-Homodimerisierung oder eine bisher noch nicht beschriebene Interaktion mit viralen oder zellulären Proteinen vermitteln. Nach Charakterisierung verschiedener rekombinanter UL36 Proteine lässt sich Folgendes zum essentiellen Tegumentprotein pUL36 des Pseudorabies Virus sagen: 1) Es konnten verschiedene Domänen innerhalb des PrV-UL36-Proteins identifiziert werden, die für die Replikation sowohl in der Zellkultur als auch im Tiermodell von unterschiedlich wichtiger Bedeutung sind. Insgesamt wurden fast 50% des Proteins deletiert, ohne einen letalen Funktionsverlust zu bewirken. 2) Der C-Terminus des UL36-Proteins des Pseudorabies Virus ist für die Funktion des Proteins im Replikationsgeschehen essentiell, was auf eine mögliche Interaktion mit Kapsid- und/oder kapsidassoziierten Proteinen zurückzuführen sein könnte. 3) Die reifen Virionen der Mutanten zeigen keine Veränderungen hinsichtlich ihrer Morphologie. Auch biochemisch wurden keine Veränderungen in der Proteinzusammensetzung der untersuchten Virionen festgestellt. 4) Keine der charakterisierten Mutanten wies einen Defekt bei der Freisetzung neugebildeter Kapside aus dem Zellkern auf, d. h., die deletierten Bereiche haben keine Bedeutung während der nukleären Phasen der Virusmorphogenese. 5) PrV-pUL36 könnte weiterhin für den Ablauf der Infektion des Nervensystems von Bedeutung sein, da eine deutliche Einschränkung der Neuroinvasion einiger Mutanten im Mausmodell beobachtet wurde.
  • PrV is the causative agent of Aujeszkys disease, a serious disease primarily affecting pigs. It has become an important model to study herpesvirus infection in cell culture and in the animal, due to its easy handling in the laboratory and excellent replication characteristics as well as its wide host range and availability of established small animal model systems (Mettenleiter et al., 2008). The tegument is the most complex and less understood part of the herpesvirus particle. In PrV, it is composed of at least 15 proteins fulfilling structural and/or regulatory roles during replication. The purpose of this study was to identify and characterize functional regions within the essential tegument protein pUL36 of the alphaherpesvirus PrV. These should shed more light on the molecular processes during viral maturation and infection in vivo. Sequence comparison of several pUL36 homologous proteins revealed only partial amino acid conservation including the N-terminal described deubiquitinating module and a small highly conserved C-terminal portion. Additionally, several protein motifs like leucine-zippers (known for protein-protein or DNA-protein-interactions), RGD-motifs and nuclear localisation signals could be identified as well as a large stretch of a proline rich region. By specific deletion or substitution several UL36 mutant proteins were constructed and tested in a trans-complementation-assay. Positive complementation yielded in isolation of recombinant virus carrying the desired deletion within pUL36. These virus mutants were characterized with regard to their replication properties in vitro and in vivo by using standard growth kinetic and plaque assay conditions as well as ultra structural studies of the morphogenesis process by electronmicroscopy. Using Western-blot- and SILAC-analyses possible changes in virion composition due to genetically engineering were verified. In a well established mouse model we were able to investigate neuroinvasion of these recombinant viruses. In summary we conclude that: 1) Several regions within PrV pUL36 could be identified and deleted without lethal loss of function during replication in vitro and in vivo. In total, approximately 50% of the protein is not essential for protein function and replication. 2) The C-terminus of PrV pUL36 is essential for replication. This could be due to a possible association of pUL36 with capsid and/or capsid-associated proteins. 3) No morphological changes of mature virions carrying deletions/substitution in pUL36 could be observed in electron microscopy studies. Western-Blot- and SILAC-analyses also revealed no changes in overall virion composition. 4) No nuclear phenotypes could be observed in cells infected with either of the characterized mutants. This indicates no functional role for the deleted regions in primary envelopment/deenvelopment during the early phase of virion morphogenesis. 5) Prolonged mean survival times of several mutants indicate slower neuroinvasion and therefore implicate exclusive functions of the deleted regions for replication in neuronal cells in vivo.

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Metadaten
Author: Sindy Böttcher
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000539-8
Title Additional (English):Functional characterization of the essential large tegument protein pUL36 of Pseudorabies Virus
Advisor:Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas C. Mettenleiter
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2008/11/21
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2008/11/04
Release Date:2008/11/21
Tag:Herpesvirus, PrV, Tegumentprotein, pUL36
PrV, herpesvirus, large tegument protein, pUL36
GND Keyword:Molekulare Virologie
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie