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Monitoring von Fermentationsprozessen mithilfe von elektrischen Biochips

  • Die at-line Expressionsanalyse von Bioprozess-relevanten Markergenen auf der Grundlage von elektrischen Biochip-Verfahren ist eine viel versprechende Strategie für eine prozessbegleitende Beurteilung der Zellphysiologie des Produktionswirtes. Eine derartige direkte Methode für die Bestimmung des physiologischen Status würde zu einer umfassenderen Überwachung und Kontrolle von industriellen Fermentationsprozessen beitragen. Die Expressionsanalyse der Markergene mit den verwendeten elektrischen Biochips beruht auf dem Nachweis der entsprechenden mRNA über eine Sandwich-Hybridisierung und der elektrochemischen Detektion der Hybride. Hierbei sind sowohl Bead-basierte als auch Array-basierte Formate möglich. Der Bead-basierte mRNA-Nachweis nutzt paramagnetische Partikel (Beads) für die Immobilisierung von Gen-spezifischen Fängersonden. Während der Hybridisierung wird die nachzuweisende mRNA auf den Beads gebunden. Gleichzeitig hybridisiert eine Detektionssonde in einem anderen Bereich der mRNA und ermöglicht so die Markierung mit einem Enzym. Dieses setzt para-Aminophenol (pAP) frei, das an den Elektroden des Biochips über zyklische Oxidations- und Reduktionsprozesse (Redox-Recycling) amperometrisch detektiert wird. Der resultierende elektrische Strom dient als Maß für die mRNA-Menge in der Probe. Die Array-basierte mRNA-Detektion nutzt elektrische Biochips mit 16 individuell auslesbaren Elektrodenpositionen. In diesem Format werden die Fängersonden direkt auf der Elektrodenoberfläche immobilisiert. Durch die Hybridisierung wird die nachzuweisende mRNA auf den jeweiligen Elektrodenpositionen gebunden. Die Detektion erfolgt positionsspezifisch über das Enzym-kontrollierte Redox-Recycling von pAP. Der Fokus der vorliegenden Arbeit lag vor allem auf der Verkürzung, Optimierung und Automation der Bead-basierten mRNA-Detektion. Durch erste Optimierungen einzelner Protokollschritte der Bead-basierten Sandwich-Hybridisierung konnte eine Verkürzung des Protokolls von ursprünglich 4 h auf unter 3 h erzielt werden. Der Übergang zu einer Sandwich-Hybridisierung in Lösung führte vor allem zu einer verbesserten Handhabbarkeit und Reproduzierbarkeit des Protokolls. Die Neuanordnung der Sondenbindestellen auf der Ziel-mRNA und die Einführung einer zweiten Detektionssonde resultierten in signifikanten Steigerungen der Hybridisierungssignale. Dies ermöglichte eine Verkürzung der Detektionszeit auf ca. 75 min. Durch weitere Optimierungen einzelner Aspekte des Protokolls konnte schließlich eine mRNA-Detektionszeit von ca. 45 min realisiert werden. Somit wurde das Protokoll für die Bead-basierte mRNA-Detektion mit dem elektrischen Biochip, ausgehend von isolierter Gesamt-RNA, von ursprünglich 4 h auf 45 min verkürzt. Gleichzeitig konnte die Sensitivität des Protokolls um das etwa Fünffache gesteigert werden. Die Automatisierung mithilfe eines Pipettierroboters erlaubte eine parallele Bearbeitung und die automatische, sequentielle Detektion von 8 Proben innerhalb von ca. 1 h. Weiterhin wurde die Array-basierte mRNA-Detektion etabliert und teilweise optimiert. Dies ermöglichte eine parallele, elektrochemische Detektion von derzeit 4 verschiedenen mRNAs in einer Probe isolierter Gesamt-RNA innerhalb von 20 min. Allerdings sind vor der automatischen Messung noch zusätzliche Schritte für die manuelle Bearbeitung der RNA-Proben (ca. 25 min) erforderlich. Die Anwendbarkeit der entwickelten Protokolle wurde jeweils am Beispiel von ausgewählten Markergenen des industriell bedeutsamen Wirtes Bacillus licheniformis getestet. Die mithilfe der elektrischen Biochip gemessenen Expressionsprofile der Markergene korrelierten mit den mittels real-time RT-PCR bestimmten mRNA-Mengen. Somit konnte im Rahmen der vorliegenden Dissertation die Grundlage für eine Bioprozess-begleitende mRNA-Analytik, basierend auf elektrischen Biochips, geschaffen werden.
  • The at-line expression analysis of bioprocess-relevant marker genes on the basis of electrical biochip techniques is a promising strategy for evaluating the host’s physiology during the bioprocess. Such a direct method for the determination of the physiological state would enable a more comprehensive monitoring and control of industrial bioprocesses. The expression analysis of marker genes with the used electrical biochips is based on the electrochemical detection of the respective mRNA via a sandwich hybridization, either by a bead-based or an array-based detection format. The bead-based mRNA detection uses paramagnetic particles (beads) for the immobilization of gene-specific capture probes. During hybridization the mRNA of interest is bound to the beads. At the same time a detection probe hybridizes to another mRNA region, allowing for the binding of an enzyme conjugate. This enzyme liberates para-aminophenyl phosphate (pAP) that is detected amperometrically at the electrodes of the biochip by cyclic oxidation and reduction processes (redox recycling). The resulting electrical current correlates with the amount of mRNA in the sample. The array-based mRNA detection uses electrical biochips with 16 electrode positions that can be read out individually. In this format the capture probes are immobilzed directly onto the electrodes. During hybridization the mRNA binds to the respective electrode positions. The detection occurs position-specific by enzyme-controlled redox recycling of pAP. The main focus of the present work was on the time reduction, optimization and automation of the bead-based mRNA detection. First optimizations of particular steps of the bead-based sandwich hybridization protocol enabled a shortening from 4 h to less than 3 h. The change to a solution-based sandwich hybridization lead to an improved handling and reproducibility. The rearrangement of the probes and the introduction of a second detection probe resulted in significantly increased hybridization signals enabling a detection time of about 75 min. Further optimizations of single protocol aspects finally facilitated an mRNA detection time of approx. 45 min. Consequently, the protocol for the bead-based mRNA detection, starting with isolated total RNA, could be reduced from 4 h to 45 min, while the sensitivity was increased by a factor of about five. The automation by means of a robotic workstation enabled the parallel processing and sequential detection of 8 samples within 1 h. In addition, the array-based mRNA detection was established and partially optimized. This enabled the parallel electrochemical detection of currently 4 different mRNAs of a sample of isolated total RNA within 20 min. However, there are additional steps necessary for the manual preparation of the RNA samples (25 min) preceding the actual measurement. The applicability of the developed protocols was verified using the example of selected marker genes of the industrially important host Bacillus licheniformis. The expression profiles of the marker genes as detected with the electrical biochips correlated with the amount of mRNAs as quantified by real-time RT PCR. In conclusion, the present thesis provided a basis for an at-line gene expression analysis by means of an electrochemical mRNA detection using electrical biochips.

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Metadaten
Author: Daniel Pioch
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000551-2
Title Additional (English):Monitoring of fermentation processes by means of electrical biochips
Advisor:Dr. Britta Jürgen, Prof. Dr. Thomas Schweder
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2008/12/19
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2008/09/30
Release Date:2008/12/19
Tag:At-line Monitoring, Bacillus licheniformis, Sandwich-Hybridisierung, elektrischer Biochip, mRNA-Detektion
At-line monitoring, Bacillus licheniformis, Electrical chip, Sandwich-hybridization, mRNA detection
GND Keyword:Biochip, Biotechnologie, Fermentation, Genexpression, Prozessüberwachung
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Pharmazie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie