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Molekulare Beziehungen zwischen dem Zellerkennungsmolekül Tenascin-R und dem Gas5-Gen: eine Genregulations- und Verhaltensstudie in der Maus (Mus musculus)

  • Das Zellerkennungsmolekül Tenascin-R spielt eine wichtige Rolle für die synaptische Plastizität im zentralen Nervensystem und für die Regulation des Verhaltens von Säugetieren. Viele der Erkenntnisse über in vivo - Funktionen von Tenascin-R wurden durch Untersuchungen der durch Insertion eines Neomycin-Resistenzgens in das Tnr-Gen hergestellten Tenascin-R-Knockout-Mäuse (Tnr-/-) erlangt. So weisen Tenascin-R-Knockout-Mäuse im Vergleich zu Wildtyp-Maus (Tnr+/+) Tieren ein deutlich ängstlicheres Verhalten und starke Defizite in der Motorkoordination auf. In der vorliegenden Arbeit sollten mögliche molekulare Mechanismen, welche die großen Unterschiede zwischen dem Verhalten der Mutante und dem wildtypischer Mäuse verursachen könnten, untersucht werden. Gene, deren Expression im Gehirn von Tenascin-R-Knockout-Mäusen im Vergleich zum Gehirn von Tnr+/+-Mäusen dysreguliert sind, sollten mit Hilfe von Expressionsprofilen identifiziert werden. Die Unterschiede zwischen den Expressionsprofilen der beiden Genotypen waren relativ gering. Dem am stärksten dysregulierten und daher eingehender untersuchten Transkript Gas5 fällt eine ungewöhnliche Funktion zu. Durch enzymatische Prozessierung entstehen aus dem Primärtranskript von Gas5 neun kleine nucleoläre RNAs (small nucleolar RNAs, snoRNAs). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass neben der Expression von Gas5 auch die einer seiner snoRNAs, nämlich U44, in Tnr-/--Mäusen im Vergleich zu Tnr+/+-Mäusen in allen untersuchten Organen dramatisch verringert ist. Um einen in Betracht gezogenen dysregulationsauslösenden unspezifischen Effekt durch die zur Herstellung der TNR-/--Maus verwendeten Neomycinkassette auf die Expression von Gas5 auszuschließen, wurde eine zweite Tenascin-R-Knockout-Mauslinie mit Hilfe einer Neomycinkassetten-unabhängigen Methode hergestellt. Beide Dysregulationen konnten mit dieser Methode, bei der das mit loxP-Elementen flankierte erste kodierende Exon des Tenascin-RGens durch die separat exprimierte Cre-Rekombinase herausgeschnitten wurde, bestätigt werden. Erstaunlicherweise wurde diese Abnahme der Expression von Gas5 und U44 auch bei Mäusen beobachtet, die keine Cre-Rekombinase exprimierten, sondern die nur die loxP-Flankierung des ersten codierenden Exons von Tnr aufwiesen. Daher wurde für die Dysregulation des Gas5- Transkriptes die Zerstörung eines regulatorischen Elementes, welches zur post-transkriptionalen Regulation von U44 und Gas5 führt, im Tnr-Gen postuliert. Nach heutigem Kenntnisstand ist dies das erste Beispiel dafür, dass das Einfügen von loxP-Sequenzen in ein Mausgen die Expression eines benachbarten Gens selektiv beeinflusst. Ferner wurde erstmals das Expressionsmuster der aus Gas5- Primärtranskripten gebildeten snoRNAs in verschiedenen Organen analysiert. Dabei zeigte sich, dass in jedem Organ deutlich verschiedene Mengen der einzelnen snoRNAs vorliegen, aber auch, dass jede einzelne snoRNA von Organ zu Organ große Expressionsunterschiede aufweist. Dies wirft die Frage auf, welche Bedeutung Gas5 und dessen snoRNAs, speziell U44, für die Physiologie der Zellen des ZNS und somit letztlich für das Verhalten der Maus haben. Zur Klärung, ob Gas5 für die bei der Tenascin-R defizienten-Maus beobachteten Verhaltensauffälligkeiten verantwortlich sein könnte, wurden Untersuchungen durchgeführt, welche zeigten, dass das basale Gas5-mRNAExpressionsniveau Unterschiede im Angstverhalten bzw. in der Stressantwort von C57Bl/6-Mäusen erklären könnte. Die Verhaltensanalysen zeigten, dass die basale Expression der Gas5-mRNA im Hippocampus, aber nicht im restlichen Gehirn negativ mit stressanzeigenden Parametern des open field - und des elevated plus maze –Tests korreliert. Mit der Leistung der Mäuse im water maze-Test, einer räumlichen Lernaufgabe, korrelierte die Gas5-Expression hingegen nicht. Dies deutet darauf hin, dass der Gas5-Level für die hippocampale Stress- und Angstantwort wichtig ist, allerdings nicht für das räumliche Gedächtnis. Darüber hinaus ist die Expression von Gas5, aber nicht die seiner snoRNAs, 24 h nach einem, für die Maus stark stressauslösenden, olfaktorischen Kontakt mit einer Ratte um bis zu 50 % erhöht. Die Tenascin-R-mRNA-Menge ist bei denselben Mäusen um 25 % vermindert. Diese Gas5-mRNA-Expressions-Änderung wird hingegen nicht bei einem gemilderten Stressreiz, wie einer neuen Umgebung, beobachtet. Dieses Ergebnis zeigt, dass geringe Stressoren wie eine neue Umgebung nicht ausreichen, um die Gas5-Expression zu stimulieren, starke Stressoren wie Rattenkontakt hingegen zu einem Anstieg der Gas5-Expression führen. Gas5 scheint eine wichtige Funktion bei der Verarbeitung von Stress einzunehmen. Diese Verarbeitung könnte in der Tenascin-R defizienten-Maus derart gestört sein, dass eine normale Stressantwort nicht möglich ist und sich diese somit letztlich auch auf die motorischen Fähigkeiten der Tenascin-R defizieten Maus auswirkt.
  • The cell recognition molecule Tenascin-R plays an important role during synaptic plasticity in the central nervous system and for the regulation of behavior in mammalian. The main knowledge of in vivo functions of Tenascin-R has been gained by investigation of the Tenascin-R deficient (Tnr-/-) mouse. Tnr-/- mice were generated by insertion of a neomycin resistance gene into the first coding exon of the tenascin-R gene. Tnr-/- mice show strong motor coordination deficits and increased anxiety and stress response in contrast to wildtype mice (Tnr+/+). The aim of this research study was to identify and investigate potential molecular mechanisms which cause this behavior alteration between the mutant and the wild type mouse. In order to identify downstream mediators of tenascin-R function in brain, we carried out a microarray gene expression analysis of brain tissue of tenascin-R-/- adult mice in comparison with samples from wild-type littermates. The small nucleolar RNA (snoRNA) host gene growth arrest-specific 5 (gas5) exhibited a significantly reduced mRNA expression in mice lacking tenascin-R. This finding could be confirmed by Northern blotting and quantitative RT-PCR (qRT-PCR). To check whether the altered mRNA level of gas5 also influences expression of the snoRNAs generated from this gene, we performed a systematic qRT-PCR analysis of the respective small RNAs. Interestingly, only one snoRNA, U44, was reduced in expression in tenascin-R-/- mice compared to wild-type animals. Moreover, expression of U25, a snoRNA localized in the host gene UHG, was not affected by tenascin-R ablation, further confirming the specificity of U44 dysregulation. Gas5 expression was not only affected in brains of tenascin-R-/- mice, but also in heart, spleen and liver, where tenascin-R is not detectable. Therefore it could be suspected that the reduction in gas5 expression might be due to genomic alterations caused by the introduction of the neomycin cassette into the tenascin-R gene, which is located on the same chromosome as gas5. To rule out this possibility, tenascin-R expression has been ablated in mice using the cre-deleter system, and in neuronal cell culture using d-siRNA, but neither of the two approaches could disprove a chromosomal structure effect. Surprisingly, even mice that carried only loxP-sites in the tenascin-R-gene but not the cre-recombinase exhibited a significantly reduced gas5 expression. Therefore, it appears likely that the murine tenascin-R gene contains control elements regulating directly or indirect the expression of gas5 and U44. The aim of this research study was to identify and investigate potential molecular mechanisms which cause this behavior alteration between the mutant and the wild type mouse . To explain if the expression alterations of gas5 and U44 could cause the behavioral changes of Tnr-/- mice the basal Gas5 mRNA expression level has been analyzed when mice were in an anxiety and/or stress condition. Based on the observation that gas5 expression in brain is highest in the hippocampus and is remarkably enhanced in aged mice, in the present study the hypothesis has been tested if gas5 may be involved in behavioural responses controlled by the hippocampus and known to be affected by age, such as cognitive and novelty-induced behaviours which are altered in tenascin-R deficient mice. It has been shown that aged (22-month-old) C57BL/6J male mice have cognitive impairments, reduced novelty-induced exploration and enhanced gas5 expression in the hippocampus compared to young (3-month-old) mice. At both ages the amount of gas5 in the hippocampus negatively correlated with novelty-induced exploration in the open field and elevated-plus maze tests. No correlations were found between performance in the water maze test and gas5 expression in the hippocampus and between gas5 expression in the rest of the brain and any behavioural parameter. Since variations in novelty-induced behaviour may reflect different activities of the stress response, it has been analyzed whether gas5 expression in the hippocampus is regulated by stressful experience. Gas5 in the hippocampus has been shown to be upregulated by 50% 24 hours after a stressor (1 hour olfactory contact with a rat) but was unchanged after spatial learning in a one-trial learning test in young mice. The present results suggest that gas5 is involved in novelty- and stress-induced responses controlled by the hippocampus. It is hypothesized that long-life corticosterone exposure may cause the age-dependent increase in gas5 mRNA in the hippocampus which may be responsible for age-related dysfunctions in the stress response observed in tenascin-R deficient mice.

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Metadaten
Author: Dunya, Ingo Meier
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000542-2
Title Additional (English):molecular connection of the cell recognition molecule Tenascin-R and the Gas5 gene: a gene regulation and behavior study in mice (Mus musculus)
Advisor:Prof. Dr. Reinhard Walther
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2009/01/21
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2008/11/07
Release Date:2009/01/21
Tag:Gas5, Micro Array, Tenascin-R, snoRNAs
GND Keyword:Real time quantitative PCR
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Med. Biochemie u. Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie