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Expression bakterieller Gene zur PHA-Synthese in Arxula adeninivorans und Untersuchungen zum Stoffwechsel der Hefe

  • Kunststoffähnliche Polymere wie Polyhydroxyalkanoate (PHA) fanden in den letzten Jahren immer größere Berücksichtigung zur Substitution von Kunststoffen. Die attraktivsten Vertreter dieser Biopolymere sind dabei das Poly-3-hydroxybutyrat (PHB),das Poly-3-hydroxyvalerat (PHV) und das Poly-3-hydroxybutyrat-co-3-hydroxyvalerat(PHBV). Für eine kostengünstige Herstellung von PHA sind allerdings biotechnologisch etablierte Erzeuger notwendig. Für eine umweltfreundliche Produktion bieten sich Hefen an. Viele Hefen sind im Gegensatz zu den PHA-synthetisierenden Prokaryoten weder virulent noch pathogen. Allerdings verfügen sie nicht über die notwendige genetische Ausstattung zur PHA-Synthese. In der vorliegenden Arbeit wurden die Gene der PHB- bzw. PHBV-Synthese aus Cupriavidus necator und Methylobacterium extorquens in das Hefegenom von Arxula adeninivorans integriert. Es wurden die Gene phbA (kodiert für eine ß-Ketothiolase), phbB (kodiert für eine Acetoacetyl-CoA-Reduktase) und phbC aus C. necator sowie phaC aus M. extorquens genutzt, wobei die beiden letzteren für PHA-Synthasen kodieren. Für die Integration dieser PHA-Gene wurden sog. YIEC (Yeast Integration Expression Cassettes) konstruiert, mit welchen die Gene in die 25S-rDNA von A. adeninivorans integriert werden konnten. Es wurden jeweils die PHA-Synthasegene phaC oder phbC mit phbA und phbB aus Cupriavidus necator integriert. Dadurch entstanden die sog. 3-fach-Transformanten (3-fach/phaC und 3-fach/phbC). Ebenso wurden die PHA-Synthasegene einzeln integriert, wodurch die sog. 1-fach-Transformanten (1-fach/phaC und 1-fach/phbC) entstanden. Im Mittelpunkt der durchgeführten Arbeiten standen die Bestimmungen der Enzymaktivitäten der rekombinanten PHA-Synthasen, die Determinierung von PHA sowie die Untersuchungen der Veränderungen der Stoffwechselintermediate durch die Integration der PHA-Gene. Bevor die vier PHA-Transformanten generiert worden waren, waren in einer Machbarkeitsstudie die PHA-Gene phbA und phbB integriert und die Expression der rekombinanten Enzyme mit Enzymaktivitätsassays nachgewiesen worden. In den vier verwendeten PHA-Transformanten (1-fach/phaC, 1-fach/phbC sowie 3-fach/phaC und 3-fach/phbC) wurden phbAp und phbBp mittels spezifischer Antikörper nachgewiesen. Die Expression der PHA-Synthasegene wurde in den PHA-Transformanten durch Enzymaktivitätsassays vorgenommen. Die PHA-Transformanten wurden mit Glukose, Acetat, Ethanol, Propion- und Buttersäure alleinig und im Shift von Glukose auf eine andere Kohlenstoffquelle kultiviert. Dabei wurde festgestellt, dass Ethanol generell von den PHA-Transformanten nicht verwertet werden kann. Parallel zu den Analysen des Wachstumsverhaltens wurden die Enzymaktivitätsassays durchgeführt. Dabei konnten neben der Glukosekultivierung erstmals auch bei Acetatkultivierung Aktivitäten der rekombinanten PHA-Synthasen nachgewiesen werden. Sowohl bei der Glukose- als auch der Acetatkultivierung zeigten die vier PHA-Transformanten verschiedene Verläufe der Aktivitäten. Für die Transformante, in welche das PHA-Synthasegen phaC aus Methylobacterium extorquens integriert worden war (1-fach/phaC), wurden sowohl für die Glukose- als auch die Acetatkultivierung die Aktivitätswerte für die PHA-Synthasen bestimmt. Für die Transformante, welche das PHA-Synthasegen phbC aus Cupriavidus necator trägt (1-fach/phbC), konnten nur bei Glukosekultivierung PHA-Synthaseaktivitäten bestimmt werden. Diese wurden während der Kultivierung geringer. Für die 3-fach-Transformante 3-fach/phaC konnten PHA-Synthaseaktivitäten sowohl für die Glukose- als auch die Acetatkultivierung bestimmt werden, die während der beiden Kultivierungen geringer wurden. Für die Transformante, welche alle drei PHA-Gene inklusive des PHA-Synthasegens phbC (3-fach/phbC) trägt, wurden während der Glukosekultivierung gleich bleibende und während der Kultivierung mit Acetat stark steigende PHA-Synthaseaktivitäten ermittelt. Mit einer Färbemethode sollte in den 1-fach-Transformanten PHB nachgewiesen werden. Dazu wurden die Farbstoffe BODIPY 493/503 und Nilrot, die speziell intrazelluläres PHB bzw. Neutrallipide färben, verwendet. Es konnte mit BODIPY 493/503 kein intrazellulär eingelagertes PHB detektiert werden. Daher handelt es sich bei den Einlagerungen um Lipide. Für eine genauere Analyse der die durch die Integration der PHA-Gene entstehenden Stoffwechselprodukte wurde eine GC/MS-Methode entwickelt. In ersten Messungen zeigte sich für die PHA-Transformanten ein Peak, der die gleiche Retentionszeit wie 3-Hydroxyvalerat (3HV), das Monomer von PHV hatte. Dieser Peak wurde auch im Kontrollstamm G1212k detektiert. Da Cupriavidus necator mit der Kohlenstoffquelle Lävulinsäure (LäS) das PHA Poly-4-hydroxyvalerat produziert, wurde Lävulinsäure in der gaschromatographischen Methode als Referenzsubstanz eingesetzt. Dabei zeigte sich, dass LäS die gleiche Retentionszeit hat wie 3HV. Anschließend wurden die Massenspektren von 3-Hydroxybutyrat (3HB), dem Monomer von PHB, sowie 3HV und LäS verglichen. Dabei erwies sich, dass der Peak gleicher Retentionszeit nicht für 3HB oder 3HV steht, sondern für LäS. Es konnten somit in keiner der PHA-Transformanten 3HB oder 3HV nachgewiesen werden. Anhand der GC/MS-Daten wurde allerdings ersichtlich, dass die Integration aller drei PHA-Gene den Stoffwechsel der Hefe A. adeninivorans stärker beeinflusst als die alleinige Integration der PHA-Synthasegene. Daher wurden Citrat, Succinat, Malat und Fumarat (als Summenparameter für Maleinsäure und Fumarsäure) sowie die Fettsäuren Palmitin-, Stearin- und Linolensäure als weitere Referenzsubstanzen eingesetzt. Es zeigten sich je nach Wahl der Kohlenstoffquelle und der Kultivierungsbedingungen Unterschiede zwischen 3-fach-Transformanten und Kontrollstamm G1212k. In der Glukosekultivierung als auch der Co-Kultivierung von Glukose und Acetat (1:2) konnten die meisten Unterschiede zwischen PHA-Transformanten und G1212k festgestellt werden. Es wurden z. B. für die Glukosekultivierung in den 3-fach-Transformanten höhere Gehalte an Fettsäuren detektiert. Daraus lässt sich eine unterstützende Wirkung der rekombinanten Proteine der PHA-Synthese zur Fettsäurebiosynthese ableiten. Bei der Acetatkultivierung wird neben der PHA-Synthese und der Fettsäurebiosynthese das zentrale Zellintermediat Acetyl-CoA auch im Glyoxylatweg genutzt. Der Glyoxylatweg findet zwar in den Peroxisomen und nicht wie PHA- und Fettsäuresynthese im Zytosol statt, wird aber in Abhängigkeit von der Kohlenstoffquelle und durch die Aktivitäten des Zitronensäurezyklus geregelt. Die höheren Gehalte an Citrat bei der Co-Kultivierung von Glukose und Acetat (1:2) geben daher einen Anhaltspunkt zur Nutzung des Glyoxylatweges. Aufgrund der erhöhten Fettsäuregehalte während der Glukosekultivierungen und der Nutzung des Glyoxylatweges bei Kultivierung mit Acetat wird ersichtlich, dass die Integration aller drei PHA-Gene dazu führt, dass vermehrt Acetyl-CoA genutzt und Acetoacetyl-CoA, das erste Zwischenprodukt der PHA-Synthese, gebildet wird. Im Zytosol der Zellen findet aber auch der Mevalonatweg für die Isoprensynthese statt. Daher liegt sowohl eine Konkurrenz um Acetyl-CoA als auch um Acetoacetyl-CoA vor. Diese Konkurrenzen führen dazu, dass keine PHA-Synthese in den PHA-Transformanten stattfindet. Deswegen wird postuliert, dass stattdessen die Fettsäuresynthese, der Glyoxylatweg und der Mevalonatweg unterstützt werden. Intensivere Untersuchungen der Stoffwechselwege in A. adeninivorans müssen noch klären wie Zitronensäurezyklus und Glyoxylatweg sowie Fettsäure- und Isoprensynthese in dieser Hefe gesteuert werden können, um ein „metabolic engineering“ zur PHB-Synthese, wie es in S. cerevisiae bereits möglich ist, auch in A. adeninivorans zu realisieren. Dazu müssen nach der Expression der rekombinanten Proteine der PHA-Synthese auch die Intermediate der Stoffwechselwege gezielter nutzbar und konkurrierende Enzymaktivitäten inhibiert werden.
  • In recent years, biopolymers like polyhydroxyalcanoates (PHA) became more an more interesting for the substitution of plastics. Nowadays three types of biopolymers are most attractive, namely poly-3-hydroxybutyrate (PHB), poly-3-hydroxyvalerate (PHV) and poly-3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate (PHBV). For cost-effective manufacturing of PHA biotechnically established producers are necessary. For an environmentally friendly production yeasts provide this feature most suitable. Nevertheless yeasts do not carry the necessary genetic pool for PHA synthesis. The successfully achieved aims of the present study were to realize the integration of genes, which synthesize PHB or PHBV respectively, into the yeast genome of Arxula adeninivorans. Therefore Yeast Integration Expression Cassettes (YIEC) had been designed to integrate the PHA genes into the 25S-rDNA of A. adeninivorans. These YIEC consist of different gene cassettes which solely or in combination generate the functional PHB or PHBV genes depending on the biochemical background of the yeast strain. This study used gene cassettes which had been taken from bacteria strains such as Cupriavidus necator and Methylobacterium extorquens. A central issue of the work was the analytical enzyme activity determination of the recombinant PHA synthases in the yeast then, the analysis of synthesized PHA and the investigation of possible changes in metabolic processes due to the integration of the PHA genes into the yeast cells. During cultivation of the new generated PHA transformants with different kinds of carbon sources (e.g. glucose, ethanol) or by shifting from the carbon source glucose to acetate it was possible to track the activity of the recombinant PHA-synthases over the cultivation time. The YIEC carrying the PHA synthase gene taken from M. extorquens (phaC) seemed to have a negligible decreasing activity while the synthase from C. necator (phbC) had stable activity but by changing the carbon source from glucose to acetate the activity got stronger in the last case. To investigate metabolic changes due to integration of the YIEC a GC/MS method had been established. First results showed a peak with the same retention time like 3-hydroxyvalerate (3HV), the monomer of PHV, which referred to standard measurements made from the plain chemical itself. Further investigations revealed that in the PHA transformants not 3HV was produced but levulinic acid. Further analysis showed the integration of the YIEC in the yeast with all three gene cassettes belonging to the PHA synthesis from the mentioned bacteria had more impact on the metabolism than the solely integration of just the YIEC with the PHA synthase gene. It could be detected that cultivation of the transformants with different kinds of carbon sources leads to a higher amount of fatty acids compared to the control strain without PHA gene integration. Thus it was proposed that the integration of PHA genes had a positive effect on the fatty acids biosynthesis. Also an increased amount of citrate was detected which can be connected to an increased activity of the glyoxylate pathway. The increase of fatty acids and glyoxylate activity leads also to the assumption that more acetyl-CoA and acetoacetyl-CoA, the first intermediates of the PHA pathway, are already available in the used yeast strain A. adeninivorans. Normally in the cytosol the mevalonate pathway and isoprene synthesis take place and compete for acetyl-CoA and acetoacetyl-CoA. Therefore it is postulated that because of this competition in the cytosol for acetyl-CoA and acetoacetyl-CoA the fatty acid synthesis, the glyoxylate pathway as well as the mevalonate pathway are supported but not the PHA synthesis. More detailed studies in A. adeninivorans have to reveal how citrate cycle and glyoxylate pathways can be influenced to make a PHB synthesis possible like already shown in S. cerevisiae. Therefore competing enzyme activities must be reduced and intermediates of metabolic pathways utilized to direct these products into the PHA synthesis.

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Metadaten
Author: Anja Scholz
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000663-9
Title Additional (English):Expression of bacterial genes for the PHA synthesis in the yeast Arxula adeninivorans
Advisor:Prof. Gotthard Kunze
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2009/09/09
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2009/04/02
Release Date:2009/09/09
GND Keyword:Arxula ade, Biochemie, Biochemische Analyse, Domäne <Biochemie>, Hefeartige Pilze, Polyhydroxybuttersäuren, Polyhydroxyfettsäuren, Stoffwechsel
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Mikrobiologie - Abteilung für Genetik & Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie
MSC-Classification:92-XX BIOLOGY AND OTHER NATURAL SCIENCES / 92Cxx Physiological, cellular and medical topics / 92C40 Biochemistry, molecular biology