Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000832-0

Aufklärung zugrunde liegender Ursachen für die interindividuelle Variabilität von Expression und Funktion der Nukleosid Diphosphat Kinase (NDPK) beim Menschen

  • Azathioprin und 6-Mercaptopurin sind wichtige Arzneimittel in der Therapie onkologischer und inflammatorischer Erkrankungen. Die Wirksamkeit dieser Medikamente ist im Wesentlichen von der Bildung aktiver Metabolite, sog. Thioguaninnukleotide (TGN), abhängig. Diese sind die Summe von Thioguanosinmonophosphat (TGMP), Thioguanosindiphosphat (TGDP) und Thioguanosintriphosphat (TGTP). Im Jahr 2005 wurde erstmals berichtet, dass das Ansprechen der Thiopurintherapie bei Patienten mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen vom Verhältnis der Metabolite Thioguanosindiphosphat (TGDP) zu Thioguanosintriphosphat (TGTP) abhängt (Neurath et al. Clin Gastroenterol Hepatol. 2005 Oct;3(10):1007-14). Es wird angenommen, dass die Konversion von TGDP zu TGTP durch das ubiquitär exprimierte Enzym Nukleosid Diphosphat Kinase (NDPK) katalysiert wird. Die interindividuelle Variabilität der humanen NDPK-Expression bzw. -Funktion und deren Bedeutung für den Thiopurinmetabolismus sind bisher nicht systematisch untersucht worden. Daher war es Ziel der vorliegenden Arbeit, zuerst den Nachweis zu führen, dass die Konversion von TGDP zu TGTP durch die NDPK katalysiert wird. Im Anschluss daran erfolgte eine systematische Analyse der interindividuellen Variabilität der relevanten NDPK-Isoformen, NDPK A und NDPK B, in verschiedenen humanen Geweben (Leber und Blutzellen). Dabei sollte auch der Einfluss von genetischen, nicht genetischen sowie epigenetischen Faktoren auf die Variabilität der NDPK-Expression untersucht werden. Dafür wurden zunächst die NDPK-Isoformen NDPK A und NDPK B rekombinant exprimiert und ein high performance liquid chromatographie (HPLC)-Assay zur Bestimmung der NDPK-Aktivität etabliert. Die Quantifizierung der NDPK-Expression auf mRNA- und Proteinebene wurde mit Hilfe von quantitativer real-time PCR bzw. durch indirekte Immunodetektion der Isoformen mit spezifischen Antikörpern durchgeführt. Um den Einfluss von genetischen und epigenetischen Faktoren auf die NDPK A bzw. B Expression zu untersuchen, wurden die Genbereiche von NDPK A (NME1) und NDPK B (NME2) sequenziert bzw. mittels Matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) analysiert. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, die beiden NDPK-Isoformen NDPK A und NDPK B in E.coli rekombinant zu exprimieren. Mithilfe des validierten HPLC-Assays zur Bestimmung der NDPK-Aktivität konnte gezeigt werden, dass beide Isoformen die Konversion von TGDP zu TGTP katalysieren können. Durch Quantifizierung der mRNA- und Proteinexpression von NDPK A und NDPK B sowie der Bestimmung der NDPK-Aktivität wurde eine systematische Analyse zur Phänotyp- (Expression bzw. Funktion) Genotyp Korrelation dieser Enzyme in humaner Leber bzw. Blutzellen durchgeführt. Dabei zeigte sich eine ausgeprägte interindividuelle Variabilität für die NDPK A- und NDPK B-Expression auf RNA und Proteinebene für beide Gewebetypen. Bei der Sequenzierung der relevanten Genbereiche für die NDPK A (NME1) wurden zahlreiche genetische Varianten identifiziert, darunter zwei bisher noch nicht beschriebene Varianten im Promotorbereich. Für die NDPK B (NME2) konnte nur eine einzige genetische Variante detektiert werden. Mit Hilfe eines neu etablierten 16-plex MALDI-TOF MS Assays wurden genomische DNA-Proben der humanen Leberbank bzw. DNA aus Blutzellen auf diese gefundenen Varianten genotypisiert. Für zwei Promotorvarianten von NME1 konnte ein signifikanter Einfluss auf die NDPK A-Expression gezeigt werden, diese wurden mittels electromobility shift assays (EMSA) auf Verlust der DNA-Bindungskapazität von Kernproteinen untersucht. Darüber hinaus wurde bei der Analyse verschiedener nicht genetischer Faktoren (z. B. Alter, Geschlecht, Raucherstatus, Alkoholkonsum, Medikation und Diagnose), ein signifikanter Einfluss auf die NDPK A- bzw. NDPK B Expression in humanen Leberproben von Patienten mit cholestatischen Leberparametern beobachtet. Untersuchungen zur Methylierung der NME1-Promotorbereiche mit einer hohen Dichte an CpG-Dinukleotiden, den sog. CpG-Inseln, konnten keinen signifikanten Einfluss des Methylierungsstatus auf die NME1/NDPK A-Expression zeigen. Ergänzende Untersuchungen mit Centre dÉtude du Polymorphisme Humain (CEPH)-Zelllinien bestätigten eine ausgeprägte Variabilität der NDPK A- und NDPK B Expression, die durch genetische Varianten nicht erklärt werden konnte.
  • Elucidation of underlying mechanisms for the interindividual variability of expression/function of human nucleoside diphosphate kinase (NDPK)

Download full text files

Export metadata

Additional Services

Share in Twitter Search Google Scholar
Metadaten
Author: Susanne Karner
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000832-0
Title Additional (English):Elucidation of underlying mechanisms for the interindividual variability of expression/function of human nucleoside diphosphate kinase (NDPK)
Advisor:Prof. Dr. Heyo Klaus Kroemer
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2010/08/24
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2010/08/16
Release Date:2010/08/24
Tag:NDPK, NM23, Nukleosid Diphosphat Kinase
GND Keyword:Pharmakogenetik
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Pharmakologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie