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Identifikation neuer Virulenzfaktoren bei Burkholderia pseudomallei

  • Burkholderia pseudomallei ist ein gram-negatives Stäbchenbakterium, das in tropischen und subtropischen Gebieten endemisch ist. Bedeutung erlangte das Bakterium als Modellorganismus für intrazelluläres Überleben. Als solches ist B. pseudomallei in der Lage in Wirtszellen einzudringen, sich aus dem Phagolysosom zu befreien, im Zytosol zu replizieren, Aktinschweife zu induzieren und sich von Zelle zu Zelle auszubreiten. B. pseudomallei ist der Verursacher der Melioidose, einer Erkrankung mit sehr unterschiedlichen klinischen Verläufen. Sowohl schwere, septische Formen mit hoher Mortalität aber auch milde chronische Manifestationen treten auf. Trotz zunehmender Beachtung in der Öffentlichkeit sind die molekularen Details seiner Virulenz weitestgehend unverstanden. Deswegen beschäftigt sich diese Forschungsarbeit mit der Identifizierung und Charakterisierung von neuen Virulenzfaktoren und -mechanismen bei B. pseudomallei. Dazu wurden mittels Tn5-Transposonmutagenese 2344 Mutanten hergestellt und auf ihre Fähigkeit Plaques in einem Agarose-überschichteten Zellmonolayer zu induzieren gescreent. Mutanten mit Defekten in Genen, die in den intrazellulären Lebenszyklus involviert sind, bilden weniger, kleinere oder keine Plaques im Vergleich zum Wildtyp. Insgesamt 44 Tn5-Transposonmutanten fielen im Screening durch eine veränderte Plaquebildung auf. Durch molekularbiologische Methoden wurden die Transposoninsertionsstellen ermittelt. Es lagen Defekte in Genen vor, die für Stoffwechselproteine, Strukturkomponenten oder hypothetische Proteinen kodieren. Weiterführend wurden die Mutanten auf ihre intrazelluläre Invasion und Replikation in Epithelzellen sowie auf ihre Aktinschweifbildung untersucht. Bei insgesamt vierzehn Mutanten konnte nach intranasaler Infektion eine starke Attenuierung in der Maus nachgewiesen werden, darunter beispielsweise eine Mutante mit einem Defekt in BPSL0918, einer Peptidyl-Proly-cis-trans-Isomerase und fünf Mutanten mit Defekten in Genen unbekannter Funktion. Um polare Effekte auszuschließen, wurde die Komplementation mit dem mini-Tn7-System für diese Tn5-Mutanten etabliert und exemplarisch an der BPSL0918-Mutante durchgeführt. Diese Forschungsarbeit zeigt, dass es möglich ist mit den hier genutzten Methoden Tn5-Transposonmutagenese und anschließendem Plaquescreening neue Virulenzgene zu identifizieren, die essentielle Funktionen im intrazellulären Überleben von B. pseudomallei übernehmen. Die weitere Charakterisierung dieser Gene kann Hinweise darauf geben, mit welchen Strategien das Pathogen sich im menschlichen Körper etabliert, ausbreitet und die Wirtsabwehr außer Kraft setzt.
  • Burkholderia pseudomallei is a gram-negative pathogen that is endemic in tropical and subtropical areas. It is a model organism for intracellular life style. B. pseudomallei is able to invade host cells, escape from the vacuole, replicate intracellularly, induce actin tails and spread from cell to cell. This pathogen causes the disease melioidosis, which is characterized by variable clinical symptoms – severe sepsis as well as mild chronic manifestations are known. Despite increasing public attention the molecular details of B. pseudomallei virulence are largely unknown. Therefore, this study focused on the identification of new virulence factors and mechanisms. Using Tn5-transposon mutagenesis we generated 2344 mutants and analysed their ability to induce plaques on cell monolayers covered with agarose. The plaque assay identifies mutants with defects in invasion, intracellular replication, actin tail formation or cell to cell spreading. In total, 44 transposon mutants showed a defect in plaque formation. The transposon insertion sites of these mutants were determined by molecular biology methods. We identified defects in metabolic, structural or hypothetical proteins. In further experiments invasion, intracellular replication and actin tail formation was examined. Altogether 14 mutants showed a strong attenuation in an intranasal infection model using BALB/c mice. The screened mutants included for example a mutant with a defect in BPSL0918, a peptidyl-proly-cis-trans-isomerase, and five mutants with defects in genes with unknown functions. To exclude polar effects, a complementation with the mini-Tn7 system was established and exemplarily demonstrated for the BPSL0918-mutant. In summary, this study successfully combined Tn5 transposon mutatagenesis and plaque screening to identify new virulence genes that are important in the intracellular life style of B. pseudomallei. Further characterisation of these promising candidate genes could reveal the strategies how B. pseudomallei can survive, replicate and escape from the immune defence in the human habitat.

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Metadaten
Author: Kristin Eske-Pogodda
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000835-3
Title Additional (English):Identification of new virulence factors of Burkholderia pseudomallei
Advisor:Prof. Ivo Steinmetz
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2010/09/10
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2010/07/07
Release Date:2010/09/10
Tag:Burkholderia peudomallei, Peptidyl-Prolyl cis trans Isomerase, Tn5-Mutagenese
GND Keyword:Virulenz
Faculties:Universitätsmedizin / Friedrich-Loeffler-Institut für Medizinische Mikrobiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie