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Strukturelle Untersuchungen von Tetracyclin-Protein-Wechselwirkungen

  • Schon kurze Zeit nach ihrer Entdeckung in den 1950er Jahren wurde bekannt, dass Tetracycline (Tcs) neben ihrer antibiotischen Wirkung auch nicht-antibiotische Effekte zeigen. In dieser Arbeit werden die strukturellen Grundlagen sowohl antibiotischer als auch nicht-antibiotischer Wirkungsweisen der Tetracycline untersucht und miteinander verglichen. Die detaillierte Beschreibung der spezifischen Wechselwirkungen zwischen Tetracyclin und den verschiedenen Proteinen wird durch Röntgen-Strukturanalysen ermöglicht. Phospholipase A2 Spezifische Wechselwirkungen der Tetracycline mit verschiedenen Proteinen sind Ursache nicht-antibiotischer Eigenschaften. Tetracycline beeinflussen durch Inhibierung von Phospholipasen A2 (PLA2), neutralen Matrixmetalloproteinasen oder alpha-Amylasen neben Entzündungen auch eine Reihe von verschiedenen Körperfunktionen. Seit einiger Zeit sind anti-inflammatorische Eigenschaften der Tcs bekannt. Die PLA2 katalysiert die erste Reaktion, die zur Bildung der Eicosanoide führt. Eicosanoide sind hormonähnliche Signalmoleküle, die als Neurotransmitter wirken und an inflammatorischen Prozessen im Körper beteiligt sind. Bei entzündlichen Krankheiten wie Rheuma oder Arthritis wurde eine vermehrte Eicosanoidproduktion beobachtet. Experimentelle Studien zeigten, dass die sekretorische Phospholipase A2 durch das Tetracyclin-Derivat Minocyclin inhibiert wird. Bei Patienten mit rheumatoider Arthritis zeigte die Anwendung von Minocyclin in ersten klinischen Tests signifikante Wirkungen. Die struktuelle Grundlage der Inhibierung der PLA2 durch Minocyclin war bislang unbekannt. Im ersten Teil dieser Arbeit wird die strukturelle Ursache einer nicht antibiotischen Wechselwirkung zwischen einer sekretorischen Phospholipase A2 und Minocyclin beschrieben. Dies ist die erste Röntgenkristallstruktur, die eine nicht-antibiotische Wechselwirkung eines Tetracyclins zeigt und somit deren strukturelle Grundlage erklärt. Die Phospholipase A2 wurde aus dem Gift der Indischen Kobra (Naja naja naja) gereinigt. Dabei konnten im Rahmen dieser Arbeit die ersten Kristalle des PLA2/Minocyclin-Komplexes gezüchtet werden. Die Qualität der Kristalle erlaubte die Sammlung von Röntgendiffraktionsdaten bei 100 K mit einer maximalen Auflösung von 1,65 Å. In der Struktur wird sichtbar, dass Minocyclin im hydrophoben Tunnel der PLA2 bindet, der zum aktiven Zentrum des Enzyms führt. Als Folge dieser Interaktion ist der Zugang für die Substratmoleküle zum aktiven Zentrum blockiert. Das Wissen über die spezifischen Interaktionen zwischen der PLA2 und Minocyclin kann verwendet werden, um eine Leitstruktur zur Entwicklung neuer anti-inflammatorischer Medikamente zu schaffen. Tetracyclin-Repressor Im zweiten Teil der Arbeit wird eine antibiotische Wirkungsweise der Tetracycline strukturell untersucht. Hier soll geklärt werden, welche Interaktionen zwischen dem Tet Repressor der Klasse D (TetR(D)) und dem Tetracyclin entscheidend sind, um den Induktionsmechanismus auszulösen und den β-Turn Typ II zu stabilisieren. Die hier vorgestellten Strukturanalysen des TetR(D)s liefern somit neue detaillierte Informationen zum Induktionsmechanismus. Das Tetracyclin-Derivat Anhydrotetracyclin (AnTc) zeigt die bisher höchste beobachtete Bindungskonstante an den TetR(D). Experimente ergaben dass AnTc in der Lage ist, den Induktionsmechanismus des TetRs auch in Abwesenheit von Magnesium-Ionen auszulösen. Es wurden Röntgendiffraktionsdaten von Komplexen des TetR(D)s mit Anhydrotetracyclin und Mg2+ oder K+ und eines Komplexes von TetR(D) mit AnTc in Abwesenheit von spezifisch bindenden Metallionen gesammelt und ausgewertet. Die Strukturananlyse ermöglicht die Aufklärung der Interaktionen zwischen dem TetR(D) und AnTc und zeigt die Eigenschaften der Metallkoordination. Außerdem wurden die Röntgenkristallstrukturen von TetR(D)-Mutanten untersucht, um weitere Informationen zu den ausschlaggebenden Interaktionen zwischen TetR(D), Tc und dem Metallion während der Induktion zu erhalten. Hierbei war speziell die TetR(D)T103A-Mutante von großem Interesse, da die Seitenkette von Thr103 entscheidend an der Stabilisation des β-Turns Typ II (His100-Thr103) beteiligt ist. Von der TetR(D)T103A-Mutante wurden jeweils mit einem Mg2+-Ion ein Anhydrotetracyclin- und ein Chlortetracyclin-Komplex analysiert. Der TetR(D)T103A-Komplex mit Anhydrotetracyclin zeigt die nicht-induzierte und der Komplex mit Chlortetracyclin weist überraschenderweise die induzierte Struktur des TetR(D)s auf. Die hier beschriebenen Strukturanalysen ermöglichen somit im Vergleich zur bekannten Struktur des TetR(D)s in Komplex mit Tetracyclin und dem physiologisch bevorzugten zweiwertigen Metallion Mg2+, die strukturelle Rolle des Metallions und weiterhin die Bedeutung der Seitenkette von Thr103 für den Induktionsmechanismus aufzuklären.
  • Soon after their discovery in the 1960s, tetracyclines (Tcs) were found to own also non-antibiotic properties apart from their antibiotic effects. In this thesis the structural basics of both the antibiotic as well as the non-antibiotic effects are investigated and compared. The X-ray crystal structure analysis facilitates a detailed description of the specific interactions between tetracycline and the different proteins. Phospholipase A2 Specific interactions of tetracyclines with different proteins are the reason for their non-antibiotic effects. Tetracyclines have various pharmacological properties, which influence many different functions in the organism. It is known that some tetracyclines can inhibit for example phospholipases A2 (PLA2), neutral matrix metalloproteases or α-amylases. For many years, tetracyclines are known to act like anti-inflammatory agents. PLA2 catalyzes the first reaction, which leads to the formation of eicosanoids. Eicosanoids are signal messengers similar to hormons, which act as neurotransmitters and participate in inflammatory processes in the body. An increased production of eicosanoids was observed in inflammatory deseases like rheuma or arthritis. Clinical tests revealed that the tetracycline derivative minocycline is able to inhibit the secretory phospholipase A2. Patients with rheumatoid arthritis benefited from first application tests with tetracyclines. The structural basis of the inhibition of PLA2 by minocycline was unknown up to now. The first part of the thesis describes the structural basis of the non-antibiotic interaction between the secretory phospholipase A2 and minocycline. This is the first X-ray crystal structure which shows a non-antibiotic interaction of a tetracycline and clarifies its structural background. The phospholipase A2 was purified from the venom of Indian Cobra (Naja naja naja). The first crystals of the complex of PLA2 with minocycline were successufully grown. From one of those crystals, diffraction data with a maximum resolution of 1.65 Å were recorded at 100 K. The structure reveales that minocycline binds in the hydrophobic tunnel of PLA2 which leads to the active site of the enzyme. Consequently, the access for the substrate molecules to the active site is blocked. The gained knowledge about the specific interactions between PLA2 and minocycline can be used to find a lead compound for the development of new anti-inflammatory drugs. Tetracycline Repressor When tetracyclines act as an antibiotic agent, they inhibit the ribosomal protein biosynthesis of prokaryotes by binding to the 30S-subunit of the ribosome. Prokaryotes developed different defense mechanisms to avoid damage by tetracyclines. The structural analysis of the antibiotic effects of the tetracyclines on TetR are presented in the second part of the thesis. The goal is to investigate the critical interactions which lead to the initiation and stabilization of the of TetR-induction mechanisms. The presented strutural analysis of TetR(D) proviedes new detailled informations about the induction mechanism. The tetracycline derivative anhydrotetracycline (AnTc) owns the highest binding constant to TetR(D) discovered to date. Experiments revealed, that AnTc is able to induce TetR(D) in absence of Mg2+-ions. The structural analysis was performed to elucidate the properties of binding and the influence of the metal ion on the induction mechanism of the tetracycline repressor by AnTc. X-ray data of TetR(D)-AnTc in complex with Mg2+ or K+ and a TetR(D)/AnTc-complex in absence of a specifically binding metal ion were collected and analysed. The structural analysis allows to clarify the interactions between TetR(D) and AnTc and presents the characteristics of the metal coordination. Furthermore, X-ray data of TetR(D)-mutants in complex with Tcs were investigated to gain new information about the crucial interactions between TetR(D), Tc and the metal ion during the process of induction. Especially, the analysis of TetR(D)T103A-mutant/Tc-complexes were of importance, since the side chain of Thr103 stabilizes the β-turn type II (His100-Thr103). The formation of the β-turn type II is the characteristical feature of the induced TetR(D). An anhydrotetracycline and a chlortetracycline (7ClTc) TetR(D)T103A-complex with Mg2+ were analysed. The TetR(D)T103A/AnTc/Mg2+-complex is not induced and the TetR(D)T103A/7ClTc surprisingly shows the induced state. This structure analysis revealed new informations about important interactions in the induction mechanism. In comparison to the known structure of the TetR(D)/Tc/Mg2+-complex, the performed structural analysis enables to clarify the importance of the physiologically preferred divalent cation Mg2+ and the side chain of Thr103 for the induction mechanism.

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Metadaten
Author: Daniela Dalm
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000875-1
Title Additional (English):Structural analysis of tetracycline-protein-interactions
Advisor:Prof. Dr. Winfried Hinrichs
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2010/12/02
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2010/11/24
Release Date:2010/12/02
GND Keyword:Antibiotikum, Kristallstruktur, Phospholipase A2, Strukturanalyse, Strukturaufklärung, Strukturverfeinerung, Tetracycline, Tetracyclinrepressor
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie