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Entwicklung serologischer Testverfahren zum Nachweis Hantavirus spezifischer Antikörper und deren Anwendung bei epidemiologischen Untersuchungen

  • Hantaviren gehören zu den „Emerging Viruses“ mit einer weltweiten Verbreitung. Sie sind Erreger von Zooanthroponosen und werden von Nagetieren auf den Menschen übertragen. Humane Hantavirusinfektionen können je nach Erreger schwerwiegende Erkrankungen mit einer Letalitätsrate von bis zu 50 % hervorrufen. In den Jahren 2004/2005, 2007 und auch in diesem Jahr wurde in einer Reihe europäischer Staaten, einschließlich Deutschland, ein deutlicher Anstieg der Zahl der humanen Hantavirusinfektionen beobachtet. In Deutschland waren hauptsächlich Baden-Württemberg, Bayern, Niedersachsen und Nordrhein-Westfalen betroffen. Zu den Risikogruppen zählen Personen, welche aufgrund ihres Berufes in engen Kontakt zu dem Reservoirwirt und dessen Ausscheidungs¬produkten kommen und somit auch gegenüber den Viren besonders exponiert sind. Die Hanta¬virus¬diagnostik basiert größtenteils auf serologischen Nachweismethoden wie Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) und Western Blot-Tests. Um humane Hantavirusinfektionen in Deutschland mit hoher Sensitivität und Spezifität zu diagnostizieren, wurden in dieser Arbeit serologische Testverfahren für die in Europa vorkommenden Hantaviren Dobrava-Belgrad-Virus (DOBV), Puumalavirus (PUUV) und Tulavirus (TULV) etabliert und validiert. Weiterhin wurden Protokolle zur Durchführung seroepidemiologischer Studien und für den Einsatz der neuen Testsysteme in der Diagnostik entwickelt. Gemäß dieser Protokolle wurden die Tests bei seroepidemiologischen Untersuchungen eingesetzt und lieferten Auf¬schluss über die Hantavirusprävalenz in verschiedenen Bevölkerungsgruppen in unter¬schiedlichen Gebieten Deutschlands. Auf der Basis Hefe exprimierter Nukleokapsidproteine (N-Proteine) von PUUV, Stamm Vranica-Hällnäs (PUUV-Vra) und Stamm Niederbayern (PUUV-Bava), DOBV, Stamm Slovenia (DOBV-Slo), und TULV, Stamm Moravia wurden ELISA und Western Blot-Tests zum Nachweis von humanen IgM- und IgG-Antikörpern entwickelt. Die Validierung mit deutschen und internationalen Seren ergab für die neuen Tests eine Sensitivität zwischen 94 % und 100 % und eine Spezifität von 96-100 %. Bei der Validierung der Tests mit Seren aus Finnland erreichte die Sensitivität 89-100 % und die Spezifität 95-100 %. Der Anteil an Seren, bei denen keine eindeutige Einteilung in „reaktiv“ oder „nicht reaktiv“ erfolgen konnte, lag bei maximal 2,7 %. Die indirekten DOBV-Slo- und PUUV-Vra-IgG/IgM-ELISA und Western Blot-Tests wurden durch INSTAND e.V. im März, September 2009 und April, September 2010 zertifiziert. Die TULV spezifischen Tests konnten aus Mangel an Referenztests und damit fehlender Referenzseren nicht validiert werden. Für die epidemiologischen Studien wurde das indirekte ELISA-Format eingesetzt, da das capture ELISA-Format in seiner diagnostischen Sensitivität schlechter als das indirekte Format abgeschnitten hatte. Die jeweiligen Western Blot-Tests und Immunfluoreszenztests dienten als Bestätigungstest. Die seroepidemiologische Studie bei 484 humanen Serumproben aus einem PUUV-Endemiegebiet in Niedersachsen zeigte eine Hanta-virusprävalenz von 7 %. Dieser Wert entspricht etwa dem Vierfachen der durchschnitt¬lichen Prävalenz des gesamten Bundesgebietes (1-2 %). Die Untersuchung von 178 Personen aus einem PUUV-Ausbruchsgebiet in Bayern ergab eine Hantavirusseroprävalenz von etwa 11 %. Interessanterweise waren 40 % der positiv getesteten Seren aus¬schließlich mit dem TULV-Antigen reaktiv. Es wurden auch die Seren von 208 in Bayern statio¬nierten Soldaten untersucht. Obwohl diese zu einer der Risikogruppen gehören, lag die Hantavirusprävalenz lediglich bei 2 %. Dagegen ergab eine Studie bei Wald¬arbeitern aus Branden¬burg dass 9 % der 563 ge¬testeten Personen Hantavirus spezifische Antikörper besaßen. Von diesen waren 43 % aus¬schließlich in den TULV-Tests reaktiv und 33 % reagierten exklusiv mit dem DOBV-Slo-Antigen. Eine ¬epidemiologische Studie bei Primaten aus dem deutschen Primatenzentrum in Göttingen zeigte, dass 12 % von den 251 getesteten Tieren mit mindestens einem der verwen¬deten Antigene reagierten. Dies stellt den ersten Nachweis von natürlichen Hantavirusinfektionen bei Primaten dar. Die Ergebnisse der epidemiologischen Studien zeigen die Bedeutung der Verwendung „homologer“ Antigene für eine hochsensitive serologische Diagnostik. Aus diesem Grund sollte zukünftig das PUUV-Bava Antigen für den serologischen Nachweis von Hantavirusinfektionen in Deutschland eingesetzt werden. Die epidemiologische Bedeutung des TULV muss weiter erforscht werden. Daher sollten bei zukünftigen epidemiologischen Studien die jeweiligen Serumproben auch auf TULV reaktive Antikörper untersucht werden. Mit den hier entwickelten serologischen Testverfahren wird es zukünftig möglich sein, Hantavirusinfek¬tionen mit hoher Sensitivität und Spezifität zu diagnostizieren.
  • Hantaviruses are emerging viruses with a world-wide distribution. They are transmitted by rodents and depending on the virus species they can cause severe diseases with a fatality rate of up to 50 % in humans. During the years 2004/2005, 2007 and also in this year a drastically increased number of human Hantavirus infections were observed in several European countries including Germany. The areas most affected in Germany were Baden-Wuerttemberg, Bavaria, Lower Saxony and Northrhine-Westfalia. People who, because of their profession, came into close contact to the rodent host and therefore in contact with the virus are considered the risk groups for Hantavirus infections. The detection of human infections are mainly based on the detection of Hantavirus specific antibodies by using serological assays such as ELISA and Western blot tests. For a highly sensitive and specific detection of human Hantavirus infections in Germany, novel serological assays for the European Hantaviruses Dobrava-Belgrade virus (DOBV), Puumalavirus (PUUV) and Tulavirus (TULV) were established and validated. In addition, protocols for the performance of these novel assays and their usage in seroepidemiological studies were defined. Based on these protocols these novel assays were used for the study of Hantavirus prevalence in different groups of the population and in in different areas of Germany. Based on the yeast cell expressed Nucleocapsidproteins (N-Proteins) from the PUUV, strain Vranica-Hällnäs (PUUV-Vra) and strain Lower Bavaria (PUUV-Bava), from the DOBV, strain Slovenia (DOBV-Slo), and from the TULV, strain Moravia new ELISA and Western blot tests for the detection of human IgM and IgG antibodies have been developed. The sensitivity of these assays defined by using sera from Germany and an international panel was 94 % to 100 % and the specificity 96 % to 100 %. By using samples from Finland the assays reached a sensitivity between 89 % and 100 % and a specificity of 95-100 %. A maximum of 2.7 % of the samples could not clearly defined as “reactive” or “non reactive”. The indirect DOBV-Slo and the PUUV-Vra IgG-/IgM-ELISA and Western Blot tests have been certified by INSTAND e.V. after ring trials in March, September 2009 and April, September 2010. In case of the TULV specific assays no validation was possible because of the lack of TULV specific reference assays and due to this by reference serum samples. Because of the lower sensitivity of the capture ELISA, the indirect ELISA was used for the seroepidemiological studies as a screening test. The Western blot test and the immunofluorescent assay were used as confirmation tests. The newly established diagnostic protocol has been used in theses studies successfully. The investigation of 484 human serum samples from a PUUV endemic area in Lower Saxony leads to a Hantavirus prevalence of 7 %. This value is nearly four times higher than the prevalence in all of Germany (1-2 %). In the study performed in a PUUV outbreak area in Bavaria 11 % out of the 178 people tested positive for Hantavirus specific IgG antibodies. Interestingly 40 % out of the positive results reacted exclusively with the TULV-Antigen. A further 208 soldiers from the same region of Bavaria have also been tested. Normally soldiers belong to the group of people with a higher risk for Hantavirus infections but in this case only 2 % of them tested positive. An opposite result could be observed when in a group of 563 forestry workers from Brandenburg had been tested. From this group 9 % of the tested individuals showed Hantavirus specific antibodies including 43 % who had an exclusive reaction with the TULV and 33 % with the DOBV antigen. A study in 251 monkeys at the German primate Center in Göttingen revealed 12 % Hantavirus positive animals. This was the first detection of a natural Hantavirus infection in monkeys. The results of the epidemiological studies highlight the importance of the usage of a homologues antigen for a highly sensitive diagnostic of Hantavirus infections. Due to this, the PUUV-Bava antigen should be used in the detection of Hantavirus infections by serology in Germany. Further the role of TULV in infections has to be further investigated. Therefore the TULV antigen should be used in following seroepidemiological studies and in diagnostics. These newly developed assays will give the possibility of a highly sensitive and specific diagnostic of Hantavirus infections in the future.

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Metadaten
Author: Marc Mertens
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000876-5
Title Additional (English):Development of serological assays for the detection of hantavirus specific antibodies and their use in epidemiological studies
Advisor:PD Dr. Rainer G. Ulrich, Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas C. Mettenleiter
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2010/12/06
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2010/11/12
Release Date:2010/12/06
Tag:Diagnostic, Hantavirus, Nucleocapsidprotein, Seroprevalence, Yeast
GND Keyword:Diagnostik, Hantavirus, Hefe, Nukleokapsidprotein, Seroprävalenz
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Mikrobiologie - Abteilung für Genetik & Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie