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Virulenzpotential des Hämagglutinins verschiedener Serotypen aviärer Influenza-Viren

  • Hochpathogene aviäre Influenza-Viren (HPAIV) entstehen aus niedrig pathogenen aviären Influenza-Viren (LPAIV) durch die Erlangung einer polybasischen Spaltstelle im Hämagglutinin (HA). Diese gilt als Hauptvirulenzdeterminante. Durch die polybasische Spaltstelle kann das HA-Vorläuferprotein ubiquitär durch Subtilisin- ähnliche Proteasen gespalten werden, was zu einer systemischen Infektion führt. Bis jetzt sind in der Natur nur HPAIV der Serotypen H5 und H7 bekannt. Es ist noch unklar, ob die Umgebung der HA-Spaltstelle in der Evolution zum HPAIV angepasst werden muss, oder ob HA vom Serotyp H5 die polybasische HA-Spaltstelle besonders schnell erwerben können und ob die artifizielle Einführung einer polybasischen HA-Spaltstelle in verschiedene LPAIV HA-Serotypen zu einem hochpathogenen Phänotyp führt. Diese drei Fragestellungen wurden in separaten Projekten in der vorliegenden Arbeit untersucht. Vergleiche der HA-Spaltstellenumgebungen zeigten, dass die meisten HPAIV H5- Isolate entweder Serin oder Threonin an Position 323 (H3-Nummerierung) des HA tragen. LPAIV H5-Isolate besitzen dagegen an der korrespondierenden Stelle Valin. Darüber hinaus weisen die meisten LPAIV H5 an Position P2 der HA-Spaltstelle ein Threonin auf. Daher wurde der Einfluss dieser beiden Positionen auf die Virulenz untersucht. Hierzu wurden monobasische und polybasische HA-Spaltstellenmutanten des HPAIV A/Swan/Germany/R65/02 H5N1 (H5/R65) mit Hilfe der reversen Genetik hergestellt. In den in vitro Untersuchungen zeigten alle monobasischen HA-Spaltstellenmutanten den erwarteten Phänotyp eines LPAIV. Beim Wachstumsverhalten führte allerdings Serin zu einer effizienteren frühen Replikation. Außerdem scheint das HA-Spaltmotiv E-R!G, welches bisher in keinem LPAIV H5 gefunden wurde, einen Nachteil gegenüber dem HA-Spaltstellenmotiv E-T-R!G zu haben, welches bei LPAIV H5- Isolaten fast ausschließlich zu finden ist. Dieser Nachteil kann allerdings durch den Austausch von Valin 323 zu Serin aufgehoben werden. Im Gegensatz dazu führte der Austausch von Serin 323 zu Valin im HPAIV H5/R65 zu keinen Unterschieden in vitro. In vivo zeigten mit H5/R65-V infizierte Hühner aber ein verlängertes Überleben. Daher ist anzunehmen, dass Serin an Position 323 zur Virulenz im Huhn beiträgt. Die Evolution vom LPAIV Vorläufer zum HPAIV scheint nicht nur den Erwerb der polybasischen HA-Spaltstelle zu benötigen sondern auch die Veränderung von Regionen außerhalb der Spaltstelle. Um zu untersuchen, ob auch andere LPAIV außer H5 und H7 in der Lage sind, polybasische HA-Spaltstellen zu erwerben, wurden Selektionsversuche durchgeführt. Die HA verschiedener Serotypen (H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9) wurden, um möglichst naturnahe Bedingungen zu schaffen, degeneriert mutagenisiert und dann ohne Zugabe einer externen Protease auf Trypsin-unabhängiges Wachstum hin selektiert. Es wurden nur von der monobasischen HA-Spaltstellenmutante des H5/R65 mit degeneriert mutagenisiertem HA, polybasische HA-Mutanten selektiert. Diese Viren zeigten eine ungewöhnliche AS-Komposition an der Spaltstelle, die weder der Wildtyp-Spaltstelle von H5/R65 noch einer natürlich bei HPAIV H5 vorkommenden Spaltstelle ähnelt. Zwei der isolierten Selektanten zeigten in weiteren in vitro Charakterisierungen den Phänotyp eines HPAIV. Da die Selektanten die restlichen sieben Gene und, außer der Spaltstelle, auch das HA mit H5/R65 gemeinsam haben, ist davon auszugehen, dass sie auch in vivo den Phänotyp eines HPAIV zeigen würden. Außerdem scheint es bei H5-Stämmen eine Prädisposition zum leichteren Erwerb einer polybasischen HA-Spaltstelle zu geben, wohingegen andere LPAIV-HA unter naturnahen Bedingungen polybasische HA-Spaltstellen deutlich schwerer erwerben können. Bei A/Chicken/Emirates/R66/02 H9N2 (H9/R66) führte die artifizielle Einführung der polybasischen HA-Spaltstellen eines HPAIV H5 oder H7 allein zwar zu Trypsin- unabhängigem Wachstum in vitro, bei Infektion von Hühnern blieb der Phänotyp aber unverändert niedrigpathogen. Die HA-Reassortante H9/R66+HAH5/R65 führte zur vorübergehenden nicht-letalen Erkrankung mit influenzatypischen Symptomen. Dagegen wies die Reassortante H5/R65+HAH9/R66mutR65 mit einem intravenösen Pathogenitäs-Index von 1,23 den Phänotyp eines HPAIV auf. Dies zeigt, dass ein HPAIV vom Serotyp H9 möglich ist, wenn das HA eine polybasische Spaltstelle erwirbt und einige oder alle anderen Gene von einem HPAIV H5 abstammen.
  • Highly pathogenic avian influenza viruses (HPAIV) evolve from low pathogenic avian influenza viruses (LPAIV) by acquisition of a polybasic haemagglutinin (HA) cleavage site, which is the main virulence determinant. Because of the polybasic HA cleavage site, the HA precursor can be cleaved by ubiquitous subtilisin-like proteases and therefore lead to systemic infection. Hitherto, only HPAIV of serotypes H5 and H7 have been found in nature. It is unknown whether the vicinity of the HA cleavage site plays a role in the evolution of HPAIV, or whether HA of serotype H5 can evolve a polybasic cleavage site faster than other serotypes, and also whether the artificial introduction of a polybasic HA cleavage site in various LPAIV HA leads to a highly pathogenic phenotype. These questions were explored in three different projects. Comparison of the vicinity of several HA showed that nearly all HPAIV H5 isolates have either serine or threonine at position 323 (H3 numbering) of the HA. LPAIV H5 isolates in contrast have valine at the corresponding site. Also most LPAIV H5 isolates have threonine at position 2 of their HA cleavage site. These two positions were investigated with a view to their effect on virulence with monobasic and polybasic HA cleavage site mutants of A/Swan/Germany/R65/02 H5N1 (H5/R65) via reverse genetics. In vitro experiments revealed that all monobasic HA cleavage site mutants showed phenotypes of LPAIV. But it seems that in growth kinetics serine at P323 is beneficent for early replication. Also the cleavage site motif E-R!G, never found in LPAIV H5, is disadvantageous to the motif E-T-R!G, found nearly exclusively in LPAIV H5. This difference can be overcome by the substitution of valine 323 for serine. By contrast, the substitution of valine 323 for serine in HPAIV H5/R65 leads to no changes in vitro. But H5/R65-V infected chickens show a prolonged lifespan in vivo. So it appears that serine at P323 is beneficial to virulence in chickens, and that the evolution from LPAIV precursor to HPAIV needs not only the introduction of a polybasic HA cleavage site but also alterations in its vicinity. The question whether other LPAIV serotypes than H5 and H7 can evolve polybasic HA cleavage sites was investigated by means of selection experiments. HA cleavage site and its vicinity of different serotypes (H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9) were mutated with degenerated primers to mimic natural conditions and then – without the addition of external proteases – selected for trypsin independent growth. In this experiment, polybasic cleavage site mutants of the mutated monobasic cleavage mutant of H5/R65 could be obtained. The selected viruses showed a unique amino acid composition at the cleavage site, which was neither found in H5/R65 nor in any natural HPAIV H5. Two of these selected viruses showed in vitro properties of HPAIV. Because the other seven genes as well as the HA gene (with the notable exception of the cleavage site) are identical to H5/R65, we can assume that they would also show HPAIV properties in vivo. Different LPAIV HA seem to obtain polybasic HA cleavage sites only with difficulties under near natural conditions, but H5 isolates seem to have a predisposition for obtaining a polybasic HA cleavage site. The artificial introduction of a polybasic cleavage site of either H5 or H7 origin into LPAIV A/Chicken/Emirates/R66/02 H9N2 (H9/R66) leads to a trypsin independent growth in vitro. In vivo, the phenotype remains low pathogenic. The reassortant H9/R66+HAH5/R65 causes temporary mild non-lethal influenza-like symptoms. On the other hand, the reassortant H5/R65+HAH9/R66mutR65 with an intravenous pathogenicity index of 1.23 shows the phenotype of an HPAIV. Therefore it is possible for serotype H9 to become an HPAIV when the HA acquires a polybasic cleavage site and some or all the other seven genes originate from HPAIV H5.

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Metadaten
Author: Sandra Gohrbandt
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000869-3
Title Additional (English):virulencepotential of haemagglutinine of different Influenza A serotypes
Advisor:Dr. Jürgen Stech, Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas C. Mettenleiter
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2010/12/08
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2010/11/12
Release Date:2010/12/08
Tag:Hämagglutinin, Spaltstellen
GND Keyword:Grippe, Influenza-A-Virus, Virulenz, Vogelgrippe
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie