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Expression thrombozytärer Antigene (Glykoprotein GP IIb/IIIa) in transgenen Pflanzenzellen

  • Die Neonatale Alloimmunthrombozytopenie (NAIT) ist eine erworbene hämorrhagische Diathese durch thrombozytäre Antikörper. Die Immunisierung der Mutter findet nach Übertritt von kindlichen Thrombozyten bereits während der ersten Schwangerschaft statt. Mütterliche Anti-Thrombozyten-IgG-Antikörper führen nach diaplazentarem Übertritt zu einem Abbau der kindlichen Plättchen im retikulo-endothelialen System. 75% aller Fälle von NAIT sind durch Anti-HPA1a-Antikörper verursacht (HPA1a/b-Polymorphismus). Dieser Polymorphismus wird durch das GPIIIa-Gen des thrombozytären GPIIb/IIIa-Rezeptors ausgebildet. Immunologische Toleranz ist die immunologische Hyposensibilität gegenüber einem Antigen. Eine Form ist die orale Toleranz (OT), bei der es durch orale Zufuhr eines Antigens zu einer spezifischen Suppression der zellulären und humoralen Immunantwort kommt. Denkbar wäre auch eine immunologische Toleranz gegenüber dem GPIIIa-Polymorphismus. Das Fernziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer transgenen zweikeimblättrigen Pflanze (Tabak/Karotte) zur oralen Toleranzinduktion im Menschen gegenüber dem HPA1a/b-Polymorphismus. Es wurde die Expression des humanen Glykoproteins GPIIIa in transgenem Tabak als Modellpflanzen systematisch untersucht. Die full-length cDNA von GPIIIa wurde schrittweise verändert und sowohl als native humane Form und als Konstrukt mit geändertem pflanzlichen Signalpeptid und einer Rückhaltesequenz in Pflanzenzellenassays getestet (Protoplastierung). Als subzelluläre Kompartimente der Versuche dienten je nach Konstrukt das Zytosol oder das Endoplasmatische Retikulum der Pflanzenzelle. Die Protoplastenassays erbrachten keinen Nachweis eines rekombinanten Proteins mit GPIIIa-spezifischen mono- und polyklonalen Antikörpern, ein RNA-Nachweis war methodisch nicht möglich. Allerdings konnte die erfolgreiche Transformation durch ein fluoreszierendes Kontrollprotein (GFP) bestätigt werden. Schließlich wurde der HPA1a-Polymorphismus in einem Proteinfragment mit einer Länge von 66 Aminosäuren in einem artifiziellen Gen rekonstruiert. Die Sequenz enthielt zusätzlich einen optimierten Pflanzenpromotor, spezifische sekretorische Signal-, tag- und Rückhaltepeptide und wurde in toto an die Pflanzenkodonusage angepasst. Mit dem Konstrukt wurde eine Tabakpflanzenlinie als Modell stabil transformiert. In den Pflanzen konnte die Integration und vollständige Transkription des synthetischen Gens mit der RT-PCR nachgewiesen werden. Die transgenen Pflanzen wurden mit GPIIIa- und tag-spezifischen Antikörpern mit unterschiedlichen Methoden (Western-Blot, ELISA) untersucht. Es wurden Versuchen zur Immunpräzipitation und Rekonstitution der Disulfidbrückenstruktur im Epitop durchgeführt. In keiner Pflanze konnte rekombinantes GPIIIa-Epitop detektiert werden. Auch der Nachweis eines unreifen Proteins anhand des c-terminalen tag-Peptides gelang nicht. Auffallend war in den Tabakzellen eine starke Kreuzreaktion eines inerten Proteins mit polyklonalen GPIIIa-Antikörpern auf Höhe der Bande des humanen GPIIIa. Es ist denkbar, daß Tabakpflanzen bereits ein GPIIIa-ähnliches Protein ausbilden und bei der Synthese von artfremden humanen GPIIIa das unreife Protein einer Degradation unterziehen oder es zu einem Gene-silencing kommt.
  • Neonatal alloimmunthrombozytopenia (NAIT) is a severe bleeding disorder caused by immunization of the mother against an alloepitope on fetal platelets. The most important polymorphisms in NAIT are located on the gene of the platelet integrin glycoprotein IIIa. A substitution of T to C on position 196 results into the diallelic human platelet alloantigen HPA 1, with leucin at positon 33 it forms HPA1a and with proline at position 33 it forms HPA1b. NAIT occurs when HPA1b-homozygote women are immunized against HPA1a-positive platelets of the fetus and the resulting antibodies then cross the placenta causing destruction of the fetal platelets. This can cause severe hemorrhage, cerebral bleeding, or death. Anti-HPA1a-antibodies are responsible for 75 % of all cases of NAIT. To date no primary or secondary prophylaxis for NAIT is established. We report experiments to express of recombinant GPIIIa and a GPIIIa fragment containing the HPA-1a polymorphism in plants to develop orally applicable plants like carots as a tool for inducing oral immuntolerance in women similar to other studies of autoimmune diseases.

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Metadaten
Author: Götz Bramsemann
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000878-4
Title Additional (English):Expression of platelet antigens (Glycoprotein GPIIb/IIIa) in transgenic plant cells
Advisor:Prof. Dr. Andreas Greinacher
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2010/12/14
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Medizinische Fakultät (bis 2010)
Date of final exam:2010/11/30
Release Date:2010/12/14
Tag:Expression, GPIIIa, Pflanzenzellen, Tabak, rekombinant
GPIIIa, expression, plant cells, recombinant, tobacco
GND Keyword:Transgene Pflanzen
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Immunologie u. Transfusionsmedizin - Abteilung Transfusionsmedizin
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit