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Entwicklung und Anwendung von Massenspektrometrie-basierten Methoden zur Identifizierung und Quantifizierung von Zelloberflächen-assoziierten Proteinen des humanpathogenen Bakteriums Staphylococcus aureus

  • Das humanpathogene Bakterium Staphylococcus aureus kann verschiedene, zum Teil lebensbedrohliche Erkrankungen wie Hautinfektionen (Furunkel, Karbunkel), Lungen-entzündung, Osteomyelitis (Knochenmarksentzündung), Endokarditis (Entzündung der Herzinnenhaut) und Sepsis auslösen. Dabei gehört S. aureus zu den häufigsten Erregern von Krankenhausinfektionen, sogenannten Nosokomialinfektionen. Deren Behandlung mittels Antibiotika stellt aufgrund von multiplen Antibiotikaresistenzen von S. aureus eine immer größere Heraus¬forderung dar, da dieser fähig ist, sich rapide an verändernde Umweltbedingungen anzu¬passen. Die Interaktion des pathogenen Bakteriums mit seiner Umwelt und seinem Wirt ist insbesondere durch den Proteinbestand, der auf der Zelloberfläche exponiert ist, bestimmt. S. aureus exprimiert ein Arsenal an Zellober-flächen-gebundenen Virulenzfaktoren, die zur Kolonisierung und Infektion von humanem Gewebe führen. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Anwendung von Massen¬spektrometrie-basierten Methoden zur Identifizierung und Quantifizierung der Zellober¬flächen¬-assoziierten Proteine von S. aureus. Dabei ist es gelungen, durch die Gel-freien und GeLC-MS/MS-basierten Methoden Biotinylierung und Trypsin-Behandlung 77% aller be-kannten Oberflächenproteine und zwei Drittel aller nach außen ragenden Membran-veran-kerten Lipoproteine von S. aureus zugänglich zu machen. Bei der Biotinylierung handelt es sich um eine Methode, bei der die Oberflächenproteine von intakten Zellen mit einem membranimpermeablen Reagenz markiert und anschließend über Affinitäts¬chroma-tographie aufgereinigt werden. Dagegen erfolgt bei der Trypsin-Behandlung die proteo-lytische Abspaltung der Oberflächen-exponierten Protein¬domänen. Erstmalig ist durch Markierung der Proteine mit stabilen Isotopen, dem sogenannten 14N/15N-metabolischen Labeling, auch eine relative Quantifizierung der Oberflächenproteine von S. aureus möglich. Bei der Analyse des Oberflächenproteoms von wachsenden und nicht-wachsenden S. aureus Zellen konnten mittels Biotinylierung 146 Oberflächenproteine identifiziert werden. Durch relative Quantifizierung wurde gezeigt, dass Zelloberflächen-assoziierte Adhäsine von S. aureus, wie der Fibrinogen-bindende clumping Faktor B, vorzugsweise während des Wachstums exprimiert werden, während nicht-wachsende Zellen erhöhte Mengen an clumping Faktor A aufweisen. Desweiteren war die Menge an immunodominanten Antigen B auf der Zelloberfläche in der stationären Phase mehr als 10-fach erhöht. Bei dieser Arbeit wurde erstmalig das Gesamt¬proteom des Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus COL, bestehend aus cytosolischem, extra¬zellulärem, Membran- und Oberflächenproteom, um¬fassend identifiziert und quantifiziert (Becher et al., 2009). Um die Pathogenität von S. aureus näher zu erforschen, wurde das Oberflächenproteom des Wildtyps mit dem einer sigB-Mutante verglichen. Der alternative Sigma-Faktor SigmaB kontrolliert ein großes Regulon bestehend aus etwa 300 Genen, von denen viele in die Virulenz von S. aureus involviert sind. Durch Kombination von 14N/15N-metabolischen Labeling, Biotinylierung und GeLC-MS/MS konnten 98 Oberflächen-proteine quantifiziert werden. Von den 49 Proteinen, die in der sigB-Mutante verändert vorlagen, waren 21 schon als SigmaB-abhängig oder durch SigmaB beeinflusst bekannt. In dieser Arbeit konnten weitere 28 Oberflächenproteine erstmalig als SigmaB-abhängig beschrieben werden. Die Gruppe der Zelloberflächen-assoziierten Proteine und Virulenz-faktoren, die durch SigmaB beeinflusst werden, wurde so erweitert (Hempel et al., 2010). Durch Trypsin-Behandlung wurden insgesamt 63 Oberflächen¬proteine beim Vergleich vier verschiedener S. aureus Stämme identifiziert. Hierbei konnte gezeigt werden, dass das Oberflächenproteom verschiedener S. aureus Stämme extrem variabel ist. Weniger als 10% der identifizierten Oberflächenproteine aller vier Stämme stimmten überein (Dreisbach et al., 2010). Eine optimale Analyse der Oberflächen¬proteine von S. aureus wird durch eine Kombination von Biotinylierung und Trypsin-Behandlung erreicht. Es konnte gezeigt werden, dass Sortase-Substrate insbesondere durch Trypsin zugänglich sind, während Lipoproteine optimal durch Biotinylierung analysiert werden können. Das Protokoll zur Trypsin-Behandlung wurde modifiziert, stark vereinfacht und ist auch zur Quantifizierung von Oberflächen¬proteinen geeignet. Durch Kombi¬nation beider Methoden mit 14N/15N-metabolischen Labeling konnten 221 Oberflächen¬proteine identifiziert und 158 quantifiziert werden. Hierbei wurde S. aureus unter Eisenmangel-bedingungen untersucht. In den Körperflüssigkeiten von Säugetieren herrschen Eisenmangelbedingungen, und diese fungieren als wichtiges Wirtssignal für die Bakterien um Virulenzproteine zu exprimieren. Unter diesen infektionsrelevanten in vitro Bedingungen wurden insbesondere Zelloberflächenproteine wie die eisenabhängigen Häm-bindenden Proteine IsdA, IsdB, IsdC und IsdD, sowie lipidver¬ankerte Eisen-bindende Proteine stark induziert gefunden (Hempel et al., unpublished).
  • The human pathogenic bacterium Staphylococcus aureus causes a wide variety of in part life-threatening diseases such as skin infections (furunculosis), pneumonia, osteomyelitis, endocarditis and sepsis. Thereby S. aureus belongs to the most prevalent pathogenic agents of nosocomial infections. Antibiotic treatment becomes more challenging because of an increasing frequency of multiple antibiotic resistances, as S. aureus is capable of adapting to rapidly changing environmental conditions. The interaction of this pathogenic bacterium with its environment and its host is specifically based on the protein set presented on the surface of the bacterial cell. S. aureus expresses an arsenal of cell surface-associated virulence factors leading to colonization and infection of human tissue. The aim of this work was the development and implementation of mass spectrometry-based approaches for identification and quantification of cell surface-associated proteins of the human pathogenic bacterium Staphylococcus aureus. Thereby access to 77% of all known cell surface-associated proteins and two thirds of all external exposed membrane-anchored lipoproteins was enabled by the gel-free and GeLC-MS/MS-based methods named biotinylation and trypsin-shaving. Biotinylation implies the labeling of cell surface-associated proteins of intact staphylococcal cells by a membrane impermeable biotinylation reagent and subsequent enrichment by affinity-chromatography. In contrast trypsin-shaving is the proteolytical digestion of all cell surface-exposed protein domains. In addition, a relative quantification of the surface-associated proteins by labeling of the proteins with stable isotopes, the 14N/15N-metabolic labeling, was enabled for the first time. Analysis of the surface-associated proteome of growing and non-growing S. aureus cells by biotinylation led to the identification of 146 surface proteins. It could be shown by relative protein quantification, that cell surface adhesins of S. aureus, as the fibrinogen-binding protein clumping factor B, were preferentially synthesized during growth, whereas clumping factor A is expressed in higher amounts on the surface of non-growing cells. Remarkably, the immunodominant antigen IsaB was present in a more than tenfold increased amount on the surface of cells in stationary phase. This work was the first comprehensive identification and quantification of the entire methicillin-resistent Staphylococcus aureus COL proteome, comprising cytosolic, extracellular, membrane und surface-associated proteome, to date (Becher et al., 2009). To address the important question of S. aureus pathogenicity, the influence of the alternative sigma factor SigmaB on the expression of cell surface-associated proteins was analyzed. Therefore, the S. aureus wild-type strain COL was compared to its isogenic sigB-mutant. SigmaB controls a large regulon in S. aureus, comprising about 300 genes, among them many with a function in virulence. By combination of 14N/15N- metabolic labeling, biotinylation, and GeLC-MS/MS 98 surface-associated proteins could be quantified. Fourty nine surface-associated proteins were modulated by SigmaB, including 21 proteins already known to be SigB-dependent or SigB-influenced. This work revealed further 28 surface-associated proteins not previously reported as SigB-dependent or -influenced, expanding the group of surface-associated proteins and virulence factors modulated by SigmaB (Hempel et al., 2010). Trypsin-shaving led to a total of 63 identified surface-associated proteins by comparing four different S. aureus strains. It could be shown, that the cell surface proteome of different S. aureus strains is extremely heterogenous. The overlap between the surface-associated proteins of the four different strains was below 10% (Dreisbach et al., 2010). An optimal analysis of surface-associated proteins of S. aureus is achieved by combination of biotinylation and trypsin-shaving. Whereas Sortase-Substrates were preferentially analysed by trypsin shaving, the biotinylation is a powerful tool for the analysis of lipoproteins. The trypsin-shaving protocol was modified, simplified and is applicable for quantification of surface proteins. By combination of both methods with 14N/15N-metabolic labeling 221 surface-associated proteins could be identified and 158 quantified. Here S. aureus was analysed under iron limitation. The iron-limited conditions in mammalian body fluids serve as a major environmental signal to the bacteria to express virulence determinants. For this infection-relevant situation particularly surface-exposed proteins were strongly induced such as the iron-regulated surface determinant proteins IsdA, IsdB, IsdC and IsdD as well as lipid-anchored iron compound-binding proteins (Hempel et al., unpublished).

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Metadaten
Author: Kristina Hempel
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000897-9
Title Additional (English):Development and implementation of mass spectrometry-based approaches for identification and quantification of cell surface-associated proteins of the human pathogenic bacterium Staphylococcus aureus
Advisor:Prof. Dr. Michael Hecker
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2011/01/11
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2010/12/22
Release Date:2011/01/11
GND Keyword:Elektronensprayionisations-Massenspektrometrie, HPLC-MS, LC-MS, MRSA, Massenspektrometrie, P, Staphylococcus aureus, Tandem-Massenspektrometrie
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie