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Die Bedeutung des Virulenzfaktors PavB und des Matrixproteins Fibronektin für die Pathogenität von Streptococcus pneumoniae

  • Pneumokokken haben verschiedene Virulenzfaktoren, die nicht nur den Kolonisierungsprozess unterstützen, sondern auch das Vordringen des Pathogens in tiefere Gewebsschichten ermöglichen oder einen Schutz vor den Komponenten des Immunsystems vermitteln. Diese Virulenzfaktoren stehen im Mittelpunkt der Untersuchungen für die aktuelle Impfstoffentwicklung. Die genomische Analyse verschiedener Streptococcus pneumoniae Stämme identifizierte den Pneumococcal adherence and virulence factor B (PavB) als LPXTG-verankertes Oberflächenprotein. PavB enthält repetitive SSURE-Sequenzen (Streptococcal Surface Repeats), die mit humanem Fibronektin interagieren. Das Molekulargewicht des hochkonservierten Proteins wird von der Anzahl der SSURE-Domänen bestimmt und variiert zwischen den unterschiedlichen Pneumokokkenstämmen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass PavB ein Adhäsin auf der Oberfläche von Pneumokokken darstellt und am Kolonisierungsprozess der Pneumokokken unter in vivo Bedingungen beteiligt ist. Mäuse, die intranasal mit pavB-Deletions-Mutanten infiziert wurden, überlebten signifikant länger als die mit den Wildtypbakterien infizierten Tiere. Der PavB-defiziente Stamm zeigte im Vergleich zum parentalen Wildtyp eine verringerte Kolonisierung des Nasopharynx sowie eine verzögerte Ausbreitung in die Lunge. Dies konnte in Echtzeit unter Verwendung von biolumineszierenden Pneumokokken gezeigt werden. In Koinfektionsexperimenten mit gleichen Infektionsdosen von Wildtyp-Pneumokokken und isogenen pavB-Mutanten war die Mutante in ihrer Fähigkeit, sich in den Organen der oberen und unteren Atemwege auszubreiten, eingeschränkt. Im Gegensatz dazu war die Pathogenese einer Meningitis nach intrazerebraler Injektion der Pneumokokken, sowie die Erkennung und Phagozytose durch phagozytierende Zellen des angeborenen Immunsystems, unabhängig von der Produktion des PavB Proteins. Die Immunogenität des Oberflächenproteins unter relevanten Bedingungen wurde durch den Nachweis von PavB-spezifischen Antikörpern in Patientenseren gezeigt. Auf eine Rolle des Oberflächenproteins PavB während der bakteriellen Adhäsion an eukaryotische Zellen deuteten die Infektionsexperimente mit humanen Epithelzelllinien. Es wurden verschiede His6-getaggte PavB-Derivate (SSURE2, SSURE2+3, SSURE1-5) für die weitere funktionelle Charakterisierung von PavB gereinigt und in Bindungsstudien eingesetzt. Die Funktion von PavB als Adhäsin konnte in Kompetitionsexperimenten unter Verwendung eines PavB-Derivats als Inhibitor bestätigt werden. Ebenso konnte die direkte Bindung des Proteins an eukaryotische Zellen nachgewiesen werden, wobei der eukaryotische Rezeptor noch nicht identifiziert wurde. In Protein-Protein-Interaktionsstudien wurden zusätzlich zu Fibronektin weitere humane Proteine des Plasmas und der extrazellulären Matrix (EZM), die im Laufe einer Infektion mit Pneumokokken einen Vorteil für das bakterielle Überleben im Wirt vermitteln könnten, als Bindungspartner für die drei gereinigten SSURE-Proteine identifiziert. Als neues Fibronektin-Bindungsprotein (FnBP) von S. pneumoniae diente PavB desweiteren für die Bestimmung der Bindungsregion von FnBPs von Pneumokokken im Fibronektinmolekül. Die Verwendung rekombinanter Fibronektinfragmente (His6-FnIII-Fragmente) ermöglichte den Nachweis der Beteiligung der Typ III-Domänen des C-terminalen Bereichs von Plasmafibronektin an der Interaktion zwischen PavB-Derivaten und Fibronektin. Die Bedeutung von Plasmafibronektin (pFn) für die Pathogenese einer Pneumonie wurde in einem induzierbaren knockout-Mausmodell für Plasmafibronektin untersucht. Nach intranasaler Infektion der Mäuse mit S. pneumoniae hatte der Verlust des Plasmaproteins unter den verwendeten Bedingungen keine signifikante Auswirkung auf die Entstehung einer Lungenentzündung oder die Überlebensaussicht der pFn-knockout-Mäuse. Unter in vitro Bedingungen bewirkte die Bindung von pFn an phagozytierende Zellen eine erhöhte Bindung der Pneumokokken an die Phagozyten. Dagegen beeinflusste die Rekrutierung von pFn an die Pneumokokkenoberfläche nicht die Phagozytose. Bisher konnte nicht eindeutig geklärt werden, welche Funktion Fibronektin während der Infektion mit Pneumokokken ausübt. Neben seinen multifunktionellen Bindungseigenschaften stellt das hochkonservierte Protein PavB einen interessanten Bestandteil für ein neues, Protein-basiertes Pneumokokkenvakzin dar.
  • Streptococcus pneumoniae (pneumococci) are human specific commensals of the upper respiratory tract. During their lifetime, most human are asymptomaticaly and probably frequently colonized by these bacteria. Under certain conditions, e.g. a host immune deficiency, pneumococci can spread in the host tissue and cause local infections such as otitis media, sinusitis or pneumonia. In some cases these infections lead to the development of severe invasive diseases like sepsis and meningitis. Several virulence determinants facilitate the colonization process but also contribute to the invasion of deeper tissue and the bacterial escape of the human immune system. These virulence factors are of high interest for the development of novel vaccines. The genomic analysis of Streptococcus pneumoniae strains identified the Pneumococcal adherence and virulence factor B (PavB) with an LPXTG membrane anchorage motif. The core of PavB consists of several repetitive sequences, referred to as SSURE (Streptococcal Surface Repeats), which interact with human fibronectin. The molecular weight of the highly conserved protein depends on the number of SSURE-domains and is variable between strains. This study demonstrates that PavB is a novel adhesin on the surface of pneumococci and contributes to nasopharyngeal colonization under in vivo conditions. Mice infected intranasaly with PavB deficient pneumococci showed significantly longer survival times compared to mice infected with the isogenic parental strain. In addition, loss of function of PavB reduced the ability to colonize the nasopharynx and affected the dissemination of pneumococci in the lungs as visualized in real-time with bioluminescent bacteria. In co-infection experiments the wild-type out-competed the pavB-mutant in infected organs of the upper and lower resperatory tract. On the other hand, the development of meningitis, as well as the uptake of pneumococci by phagocytotic cells was not impaired by PavB. Sera of patients suffering of pneumococcal diseases contained PavB-specific antibodies whereby the immunogenicity of PavB was demonstrated under relevant conditions. Infections of epithelial cells suggested a function of PavB as adhesin. For the characterisation of PavB, three different his6-tagged derivates of PavB were produced to conduct binding experiments with host proteins and cells. The use of one of these derivates as inhibitor in competition assays confirmed the function of PavB as adhesin. In addition the direct binding of the protein to eukaryotic cells certified the existence of an eucaryotic receptor, which could not be identified up to now. Apart from fibronectin, further human plasma and extracellular matrix (ECM) proteins that could contribute to the bacterial survival in the host were shown to interact with SSURE proteins as indicated in protein-protein-interaction studies. Surface plasmon resonance studies (SPR) demonstrated the interaction of the PavB derivates with fibronectin and plasminogen. Remarkably, the binding capacity of PavB derivates for human vitronectin and complement factor H was dedicated by the number of repeats. Due to its role as a fibronectin binding protein (FnBP), PavB was chosen for the determination of the binding region of pneumococcal FnBPs within the fibronectin molecule. Using some recombinant fragments of fibronectin (His6-FnIII fragments), the involvement of all type III domains of the carboxyterminal part of fibronectin in the interaction with the pneumococcal protein derivate was proven. The impact of plasma fibronectin (pFn) in the pathogenesis of pneumonia was analyzed using an inducible mouse knockout model. After intranasal infection with S. pneumoniae, deficiency in pFn did not significantlly affect the development of pneumonia or survival times of pFn knockout mice. Under in vitro conditions an enhanced binding of pneumococci to human phagocytes coated with pFn was observed, while pFn, recruited to the pneumococcal surface, did not influence phagocytosis. So far, the role of plasma fibronectin for the pathogenicity of pneumococci could not be elucidated. However, fibronectin binding proteins like PavB could assist with understanding the interaction of pneumococci with this human protein in prospective studies. Beside its multifunctional binding capacities to human proteins of the plasma and the ECM, PavB is a highly conserved, surface-exposed pneumococcal protein that might represent a component for a protein-based vaccine.

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Metadaten
Author: Inga Jensch
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000901-7
Title Additional (English):The role of the virulence factor PavB and the matrix protein Fibronectin for the pathogenicity of Streptococcus pneumoniae
Advisor:Prof. Sven Hammerschmidt
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2011/01/11
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2010/12/22
Release Date:2011/01/11
Tag:Fibronektinbindungsprotein, PavB, Plasminogenbindungsprotein, Virulenzfaktor S. pneumoniae, Vitronektinbindungsprotein
Fibronectin binding protein, PavB, Plasminogen binding protein, Vitronectin binding protein, virulence factor S. pneumoniae
GND Keyword:Streptococcus pneumoniae
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie