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Non-viraler Gentransfer mit NanoCaPs in vitro und in vivo

  • Im Bereich der Orthopädie und Traumatologie fordern die zunehmende Zahl an Non-Union- und Delayed-Union-Frakturen sowie auch aus volkswirtschaftlicher Sicht die zunehmend alternde Gesellschaft mit entsprechend medizinischen Komplikationen neue Ansätze im Bereich des Tissue Engineerings. Bisherige Fortschritte diesbezüglich lassen sich hauptsächlich im Bereich des viralen Gentransfers mit Knocheninduktion durch Bone morphogenic Proteins (BMPs) sowie durch die Verwendung von Matrixgerüsten mit entsprechenden Plasmiden erkennen. Rückschläge im Bereich des viralen Gentransfers sowie die große Aufwendigkeit in der Herstellung der Matrixgerüste fordern jedoch andere Methoden. Hierbei ist Calcium-Phosphat als non-viraler Vektor eine Möglichkeit. Sfeir et al. entwickelten Nanopartikel aus Calcium-Phosphat (NanoCaPs), die die gewünschte Plasmid-DNA schützend umschließen und in die Zelle transportieren. Da die Transfektion durch viele Faktoren beeinflusst wird, erfolgte die Optimierung dieser für HeLa-Zellen in vitro. Als Markerplasmid fand das gWIZ™ (Green Fluorescent Protein) Verwendung. Die untersuchten und variierten Parameter waren die Inkubationszeit der Transfektionslösung auf den Zellen, Mediumzusätze wie Serum und Antibiotikum sowie unterschiedliche Verhältnisse von Vektor zu DNA. Hierbei konnte eine optimale Inkubationszeit von 48 Stunden eruiert werden. Weiterhin ergab sich die Notwendigkeit von Serum als Mediumzusatz, wobei die Hinzugabe von Antibiotikum als fakultativ zu bewerten ist. Ein optimales Konzentrationsverhältnis konnte bei 1 : 5 bzw. 1 : 10 (DNA zu NanoCaPs) gefunden werden. Vergleichend fanden Untersuchungen mit einem etablierten Vektorsystem, dem kationischen Lipid Lipofectamine™ 2000, statt. Eine ähnliche Optimierung wie bei den NanoCaPs erfolgte, wobei sich hierbei gute Ergebnisse bei Konzentrationsverhältnissen von 1 : 4 sowie 1 : 5 (DNA zu Lipofectamine™ 2000) ergaben. Im quantitativen Vergleich dieser beiden non-viralen Vektorsysteme mittels FACS-Analyse konnten bei den NanoCaPs durchschnittlich 5,9 % transfizierte Zellen bei einem Verhältnis von 1 : 5 (DNA zu NanoCaPs) und bei einem Verhältnis von 1 : 10 (DNA zu NanoCaPs) 11,7 % detektiert werden. Bei Lipofectamine™ 2000 ergaben sich für das Konzentrationsverhältnis 1 : 4 (DNA zu Lipofectamine™ 2000) durchschnittlich 16 % transfizierte Zellen und bei 1 : 5 (DNA zu Lipofectamine™ 2000) 19,7 %. Mittels dieser Nachweismethode werden jedoch nur lebende Zellen gezählt, so dass der bekannten Zytotoxizität des Lipofectamine™ 2000 nur ungenügend Beachtung geschenkt wird. So wird der Anteil transfizierter Zellen zugunsten des Lipofectamine™ 2000 verschoben. Für Calcium-Phosphat hingegen konnte mikroskopisch keine Zytotoxizität beobacht werden und auch in der Literatur ist diese in nur sehr geringem Maße beschrieben. Mit dem Ziel, die NanoCaPs später im Bereich der Knochenbruchheilung zur Proteininduktion einzusetzen, erfolgten weitere Versuchsreihen mit NanoCaPs in vivo. Hierbei konnte bei subkutaner Applikation beim Kaninchen eine erfolgreiche Transfektion mit einzelnen Unterbrechungen für 7 Tage detektiert werden. In Hinblick auf die Hinzugabe von Fibrin als Lösungsstabilisator bzw. Carrier-Matrix zu den NanoCaPs konnte keine Veränderung im Transfektionsergebnis beobachtet werden. Auch in vivo wurden verschiedene Konzentrationsverhältnisse angewendet, wobei sich bei einem Verhältnis von 1:4 (DNA:NanoCaPs) an 5 Tagen positive Banden für GFP im Western Blot zeigten. Weiterhin erfolgte die In-vivo-Testung bei einem Critical-Size-Modell am Kaninchenfemur. Hierbei konnte insgesamt jedoch nur eine positive Bande erkannt werden. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die NanoCaPs erfolgreich in vitro wie auch in vivo transfizieren. Bei der Anwendung in vitro Bedarf es - wie bei anderen non-viralen Vektorsystemen auch - einer Feinabstimmung der einzelnen Parameter, um eine optimale Transfektionseffizienz zu erreichen. Wenn auch in vivo eine deutlich geringere Anzahl an transfizierten Zellen vorlag, so konnte in anderen Studien gezeigt werden, dass schon bei 0,1 % an transfizierten Zellen ein biologischer Effekt durchaus möglich ist. Dieser biologische Effekt könnte in zukünftigen Studien mittels Verwendung eines Bone Morphogenic Proteins anstelle des Green Fluorescent Protein als Genprodukt untersucht werden.
  • In the area of orthopaedics and traumatology, the increasing number of non union and delayed union fractures as well as economic factors related to an increasingly ageing population with corresponding medical complications require new approaches in the field of tissue engineering. Until now, progress has mainly been made in the field of viral gene transfer with bone induction using bone morphogenetic proteins (BMPs) as well as by use of matrix scaffolds with appropriate plasmids. However, setbacks in the field of viral gene transfer and significant difficulties in producing the matrix scaffolds require other methods. One possibility is the use of calcium phosphate as a non-viral vector. Sfeir et al. developed nanoparticles of calcium phosphate (NanoCaPs), which enclose and protect the desired plasmid DNA and transport it into the cell. Since transfection is affected by many factors, the process was optimised for HeLa cells in vitro. gWIZ™ (Green Fluorescent Protein) was used as a marker plasmid. The studied and varied parameters were the incubation time of the transfection solution on the cells, medium supplements such as serum and antibiotics as well as different ratios of vector to DNA. An optimal incubation time was found to be 48 hours. It was also found necessary to include serum as a medium supplement, while addition of an antibiotic can be regarded as optional. An optimal concentration ratio could be found at 1:5 resp. 1:10 (DNA to NanoCaPs). Comparative studies were carried out with an established vector system, the cationic lipid Lipofectamine™ 2000. A similar optimisation was performed as with the NanoCaPs; in this case good results were obtained with concentration ratios of 1:4 as well as 1:5 (DNA to Lipofectamine™ 2000). In a quantitative comparison of these two non-viral vector systems by FACS analysis, the mean percentage of transfected cells with NanoCaPs was 5.9% at a ratio of 1:5 (DNA to NanoCaPs) and 11.7% at a ratio of 1:10 (DNA to NanoCaPs). The mean percentage of transfected cells with Lipofectamine™ 2000 added up to 16% for the concentration ratio of 1:4 (DNA to Lipofectamine™ 2000) and 19.7% at the ratio of 1:5 (DNA to Lipofectamine™ 2000). However, only living cells are counted with this detection technique, so that the known cytotoxicity of Lipofectamine™ 2000 is taken into account only insufficiently. Thus the proportion of transfected cells is shifted in favour of Lipofectamine™ 2000. By contrast, microscopy revealed no cytotoxicity for calcium phosphate and also very minor cytotoxicity has been reported for calcium phosphate in the literature. Further series of in vivo experiments were carried out with NanoCaPs with the goal of applying them at a later stage for protein induction in the field of bone fracture healing. A successful transfection with single interruptions could be detected for 7 days with subcutaneous administration in rabbits. No change in the transfection result could be found when fibrin as a solution stabiliser or carrier matrix was added to the NanoCaPs. Different concentration ratios were also used in vivo, whereby with a ratio of 1:4 (DNA:NanoCaPs) at 5 days positive bands for GFP in Western blots were found. In vivo testing was also carried out with a critical-size model using the rabbit femur. However, only a single positive band could be identified in this case. In summary, it can be concluded that NanoCaPs allow successful transfection in vitro as well as in vivo. For in vitro use, careful adjustment of the individual parameters is necessary to achieve an optimal transfection efficiency, as with other non-viral vector systems. Although a distinctly smaller number of transfected cells was found in vivo, other studies have shown that a biological effect is quite possible already with 0.1% of transfected cells. Future studies could investigate this biological effect using a bone morphogenic protein as a gene product in place of the green fluorescent protein.

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Metadaten
Author: Julia Maria Nonn
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000902-2
Title Additional (English):Non-viral gene transfer with NanoCaPs in vitro and in vivo
Advisor:Prof. Dr. Harry Merk
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2011/01/14
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Medizinische Fakultät (bis 2010)
Date of final exam:2010/12/01
Release Date:2011/01/14
Tag:non-viral
non-viral
GND Keyword:Gentransfer, Knochenbruch, Knochenersatz
Faculties:Universitätsmedizin / Klinik und Poliklinik für Orthopädie und Orthopädische Chirurgie
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit