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Regulation of protein quality control systems in low GC, Gram-positive bacteria

  • Protein quality control systems are essential for the viability and growth of all living organisms. They protect the cell from irreversible protein aggregation. Because the frequency of protein misfolding, which ultimately results in protein aggregation, varies with the environmental conditions, the amount and activity of protein quality systems have to be accurately adapted to the rate of protein misfolding. The main goal of this thesis was to gain detailed molecular insights into the transcriptional and post-translational regulation of these protein quality control networks in the ecologically, medically and industrially important phylum of low GC, Gram-positive bacteria. In these bacteria the core protein quality control systems are under the transcriptional control of the global repressor CtsR. In a first study it was demonstrated that the arginine kinase McsB is not responsible for the regulation of CtsR activity during heat stress, as was concluded by others on the basis of previous in vitro data. Rather, it was demonstrated that CtsR acts as an intrinsic thermosensor that adapts its activity to the surrounding temperature. CtsR displays a decreased DNA binding at higher temperatures, which leads to induction of transcription of the protein quality control systems under these conditions. This CtsR feature is conserved in all low GC, Gram-positive bacteria. However, the CtsR proteins of various low GC, Gram-positive species do not have the same temperature optima. CtsR responds to heat in a species-specific manner according to their corresponding growth temperature. Detailed analysis revealed that a highly conserved tetra-glycine loop within the winged helix-turn-helix domain of CtsR is responsible for thermosensing. Dual control of CtsR activity during different stresses was demonstrated for the first time in this work. In addition to heat-dependent de-repression, CtsR is inactivated by thiol-specific stress conditions. This latter de-repression depends on a molecular redox-switch that is independent of CtsR auto-regulation. In Bacillus subtilis and its closest relatives the McsA/McsB stress-sensing complex is responsible for CtsR de-repression during redox stress conditions. McsA is able to sense the redox state of the cell via its highly conserved cysteine residues. When these cysteines are reduced, McsA is able to bind and inhibit McsB. But when these cysteine residues are oxidized, McsB is released from McsA. Thereby, McsB is activated and removes CtsR from the DNA. However, the McsA/McsB complex is not present in all low GC, Gram-positive bacteria. In the species lacking this complex, ClpE is able to act as a redox-sensor probably via its highly conserved N-terminal zinc finger domain. When these cysteine residues are oxidized, ClpE is activated which results in CtsR de-repression. In addition to the transcriptional regulation of CtsR low GC, Gram-positive protein quality control systems are regulated post-transcriptionally. The expression of the McsA/McsB adaptor pair is regulated by CtsR. However, McsB activity is also tightly regulated by three different regulatory proteins (McsA/ClpC/YwlE). McsB is needed to target specific substrates to ClpC, either for refolding or degradation by the ClpCP protease. It was demonstrated that only the auto- phosphorylated form of McsB is able to bind to its substrates. This McsB function is inhibited in non-stressed cells by a direct interaction with ClpC. Consequently, McsB is activated by a release from ClpC during protein stress. In addition, McsB activation depends on the presence of its activator McsA. Accordingly, McsB cannot be activated as an adaptor protein during thiol-specific stress because McsA is no longer able to bind to McsB under these conditions. However, also active McsB is subject to post-translational control. Activated McsB is either de-phosphorylated by McaP or degraded by ClpCP ensuring an appropriate shut-down of the McsB adaptor. Both McaP and ClpC inhibit McsB activity with different intensities. ClpC possesses a stronger impact on McsB activity than McaP but both proteins are needed for an adequate silencing of McsB activity. In addition, it was shown for the first time that B. subtilis McsB is a global adaptor that influences the stability of multiple proteins. The B. subtilis ClpC protein is unlike most members of the Hsp100 family because it not only requires several adaptor proteins for substrate recognition but also for its general ATP- dependent activity. Biochemical analysis revealed how ClpC is activated by distinct adaptor proteins. McsB modulates ClpC activity by regulatory phosphorylation of arginine residues. Moreover, McaP (formerly YwlE) was identified as an arginine phosphatase that modulates the McsB mediated ClpC activity. MecA, another known adaptor protein for ClpC, activates ClpC independently of these arginine phosphorylations, which demonstrates the existence of multiple pathways for ClpC activation.
  • Protein-Qualitäts-Kontrolle ist überlebenswichtig für alle Lebewesen, um die Zellen vor Schädigung durch Proteinaggregate zu schützen. Die Protein-Denaturierung, welche letztendlich zur Aggregierung von Proteinen führt, ist abhängig von den vorherrschenden Lebensbedingungen. Deswegen muss die zelluläre Menge als auch die Aktivität der Protein-Qualitätssysteme akkurat an die Protein-Denaturierung angepasst werden. Das Ziel dieser Arbeit war ein tiefergehendes Verständnis der transkriptionellen als auch der post-translationalen Kontrollen der Protein- Qualitätssysteme in der medizinisch, ökologisch und biotechnisch wichtigen Klasse der Gram- positiven Bakterien mit niedrigem GC-Gehalt zu erlangen. In diesen Bakterien stehen die wichtigsten Protein-Qualitätssysteme unter der transkriptionellen Kontrolle von CtsR. Es konnte gezeigt werden, dass nicht wie bisher vermutet die Arginin-Kinase McsB verantwortlich ist für die Regulierung der CtsR-Aktivität bei Hitzestress- Bedingungen. Stattdessen konnte gezeigt werden, dass CtsR ein intrinsischer Hitzesensor ist, der seine Aktivität der umgebenden Temperatur anpasst. CtsR zeigt unter Hitzestress verminderte DNA-Bindung, was zu einer erhöhten Transkription der Gene der Protein-Qualitätssysteme führt. Diese Fähigkeit von CtsR ist konserviert in allen Gram-positiven Bakterien mit niedrigem GC- Gehalt, jedoch haben die einzelnen CtsR Proteine nicht das gleiche Temperaturoptimum. CtsR hat sich an die spezifischen Lebensumstände der verschiedenen Spezies angepasst. Des Weiteren konnten molekulare Details von CtsR charakterisiert werden, die ihn als Temperatursensor auszeichnen. Eine hochkonservierte Tetra-Glycin Schleife innerhalb der „winged Helix-Turn-Helix Region“ von CtsR ist dafür offensichtlich verantwortlich. Zum ersten Mal konnte die zweifache Kontrolle der CtsR Aktivität bei unterschiedlichen Stressbedingungen beschrieben werden. Zusätzlich zu der hitzeabhängigen Inaktivierung von CtsR wird dieser auch während Thiol-spezifischen Stressbedingungen inaktiviert. Diese Inaktivierung ist abhängig von einem molekularen Redox-Schalter, der unabhängig von CtsR ist. In Bacillus subtilis und seinen nächsten Verwandten ist der Stress-Sensor-Komplex McsA/McsB dafür verantwortlich. McsA kann über seine hochkonservierten Cysteine den Redoxstatus der Zelle messen. Solange diese Cysteine reduziert sind, ist McsA in der Lage mit McsB zu interagieren und dadurch McsB zu inhibieren. Sobald die Cysteine von McsA jedoch oxidiert werden, wird McsB freigegeben. Dadurch wird McsB aktiviert und kann CtsR von der DNA lösen. Der McsA/McsB Komplex ist jedoch nicht in allen Gram-positiven Bakterien mit niedrigem GC-Gehalt vorhanden. In diesen Spezies agiert ClpE mit seinen hochkonservierten N-terminalen Zink-Finger als Redox-Sensor. Sobald diese Cysteine oxidiert werden, wird ClpE aktiviert um CtsR zu inaktivieren. Zusätzlich zu der transkriptionellen Kontrolle durch CtsR konnte gezeigt werden, dass die Protein-Qualitätssysteme auch auf ihrer Aktivitätsebene reguliert werden. Der Adaptor-Komplex McsA/McsB ist durch CtsR auf der Ebene der Transkription reguliert. Allerdings ist die McsB Aktivität auch durch drei weitere Regulatoren (McsA/ClpC/YwlE) kontrolliert. McsB ist notwendig um spezifische Substrate an ClpC zu übergeben, entweder für die Renaturierung oder Degradation. Jedoch ist nur die auto-phosphorylierte Form von McsB in der Lage CtsR zu binden. Diese McsB Aktivierung ist in nicht gestressten Zellen inhibiert durch eine Interaktion von McsB mit ClpC. McsB wird aktiviert durch eine Freisetzung von ClpC und der Gegenwart von McsA. Deswegen kann McsB nicht unter Thiol-spezifischen Stressbedingungen aktivert werden, weil McsA unter diesen Bedingungen nicht mit McsB interagieren kann. Zusätzlich zur Aktivierung ist auch die De- Aktivierung von McsB reguliert. Die aktivierte Form von McsB wird entweder de-phosphoryliert durch McaP oder umgehend abgebaut durch die ClpCP Protease, wodurch die Abschaltung der McsB Aktivität gewährleistet wird. Jedoch inhibiert ClpC McsB stärker als McaP. Allerdings sind beide Proteine notwendig für die komplette Inhibierung von McsB. ClpC aus B. subtilis stellt eine Ausnahme innerhalb der HSP 100 Familie dar, denn es braucht spezifische Adaptor Proteine nicht nur für die Substrat Erkennung, sondern auch für seine allgemeine ATPase Funktion. Erstmals konnten die molekulare Details dieser Adaptor vermittelten ClpC Aktivierung aufgeklärt werden. Es konnte gezeigt werden, dass ClpC spezifisch durch McsB vermittelte Phosphorylierungen an Argininen aktiviert wird. Zusätzlich konnte McaP als modulierende Arginin Phosphatase identifiziert werden, welche die McsB-vermittelte ClpC Aktivität kontrolliert. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass ein weiteres Adaptor Protein namens MecA ClpC unabhängig von diesen Arginin-Phosphorylierungen aktivieren kann, was die Existenz verschiedener ClpC Aktivierungsmechanismen nahelegt.

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Metadaten
Author: Alexander Elsholz
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000971-9
Title Additional (English):Regulation of protein quality control systems in low GC, Gram-positive bacteria
Title Additional (German):Regulation von Proteinqualitätssystemen in Gram-positiven Bakterien mit niedrigen GC-Gehalt
Advisor:Prof. Dr. Michael Hecker
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2011/05/03
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2011/04/19
Release Date:2011/05/03
Tag:Genexpression, Proteolyse, Signaltransduktion
gene expression, proteolysis, signal transduction
GND Keyword:Genexpression, Proteolyse, Signaltransduktion
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie