Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001133-9

Untersuchungen zum Strukturprotein E(rns) des Virus der Bovinen Virusdiarrhoe

  • Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden BVDV-Mutanten mit Deletionen, Insertionen oder Substitutionen in der E(rns)-kodierenden Genomregion ausgehend von den infektiösen cDNA-Klonen pA/BVDV und pA/BVDV/Ins- (Meyers et al., 1996) generiert. Die meisten Veränderungen verhinderten die Entstehung infektiöser Virionen, so dass nichtessentielle Regionen im E(rns)-Protein nicht identifiziert werden konnten. Eine Ausnahme stellen die Aminosäuren 105-108 dar, deren Substitution im Zusammenhang mit adaptiven Mutationen toleriert wurde. Mit Hilfe von Zelllinien, die die BVDV-Strukturproteine konstitutiv exprimieren, konnte eine Mutante mit einer kompletten E(rns)-Deletion und einer internen EMCV-IRES im Genom effizient trans-komplementiert und sogenannte DISC-Viren erhalten werden. Außerdem wurden Plasmide für die Expression der BVDV-Strukturproteine (C, E(rns), E1, E2) hergestellt, mit deren Hilfe erstmals ein nicht-prozessiertes E(rns)-E1-Protein mit 60-65 kDa identifiziert werden konnte, das für mindestens 3 h relativ stabil in transfizierten Zellen vorlag. Durch Mutation der P3-Position eines SPP-Motivs gelang es, sowohl in pCITE-2a(+)-Expressionsplasmiden als auch in BVDV-Vollängen-Mutanten die Spaltung dieses E(rns)-E1-Proteins zu verhindern. Dadurch konnte gezeigt werden, dass die E(rns)-E1-Spaltung essentiell für die Bildung infektiöser Viren ist. Bicistronische Mutanten wurden genutzt, um zu zeigen, dass das E(rns)-E1-Protein selbst jedoch nicht notwendig, aber förderlich für Entstehung infektiöser Virionen ist. Weiterhin konnte mittels eines im Rahmen dieser Arbeit generierten polyklonalen Bungowannah Virus-E(rns)-spezifischen Kaninchenserums, das E(rns)-Protein des atypischen Pestivirus Bungowannah Virus in Western Blot-Analysen mit etwa 38 kDa detektiert werden. Da jedoch kein Bungowannah Virus-E(rns)-E1-Protein nachgewiesen werden konnte, spielt E(rns)-E1 möglicherweise keine oder eine untergeordnete Rolle im Bungowannah Virus-Replikationszyklus. BVDV-E(rns)-Deletionen im CP7-Hintergrund konnten erfolgreich mit Bungowannah Virus-E(rns) komplementiert werden, wenn Bungowannah Virus-E(rns) und BVDV-E1 unabhängig von einer E(rns)-E1-Spaltung exprimiert wurden. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war es schließlich, eine effiziente Methode zur Konzentrierung und Reinigung infektiöser BVDV aus infizierten Zellen zu etablieren. Zum ersten Mal wurden BVDV-Mutanten mit FLAG-markierten E(rns)- und E2-Proteinen generiert, so dass erstmalig BVDV mittels Affinitätschromatografie gereinigt und elektronenmikroskopisch untersucht werden konnten. Mittels Negativkontrast-Elektronenmikroskopie wurden sphärische Partikel mit Durchmessern von 43-58 nm dargestellt. Sowohl durch affinitätschromatografische Virusreinigung als auch durch immunelektronenmikroskopische Untersuchungen konnte eine Assoziation von E(rns)- und E2-Proteinen mit der BVD-Virushülle demonstriert werden. Die in dieser Arbeit vorgestellte Methode kann als Basis für weiterführende Untersuchungen zur Morphogenese von Pestiviren genutzt werden.
  • In this study, BVDV mutants with deletions, insertions or substitutions in the E(rns)-encoding genomic region were generated on the basis of the infectious cDNA clones pA/BVDV and pA/BVDV/Ins- (Meyers et al., 1996). Most of the changes within the E(rns)-encoding region were lethal and therefore non-essential regions for the generation of infectious virions could not been defined. The only exception was the substitution of amino acids 105-108 which was tolerated in combination with adaptive mutations. With the help of recombinant cell lines, constitutively expressing the BVDV structural proteins, a mutant with a complete E(rns) deletion and an internal EMCV-IRES could be successfully trans-complemented and DISC viruses were generated. Furthermore, plasmids for the expression of the BVDV structural proteins (C, E(rns), E1, E2) were generated. With the help of those constructs, an E(rns)-E1 protein with 60-65 kDa, which remained stable for at least 3 h in transfected cells, was identified. Mutation of the P3 position of a putative SPP motif in pCITE-2a(+) as well as in BVDV full length mutants abolished cleavage of the E(rns)-E1 protein. Therefore, it could be demonstrated that cleavage of the E(rns)-E1 protein is essential for the generation of infectious virus progeny. With bicistronic mutants it could further be shown that the E(rns)-E1 protein itself is not essential but beneficial for the generation of infectious virions. Furthermore, with a newly generated polyclonal rabbit serum, an E(rns) protein with about 38 kDa could be detected in Western blot experiments for the atypical pestivirus Bungowannah. An E(rns)-E1 protein was not identified and therefore maybe such a protein plays no or only a minor role in the Bungowannah virus replication cycle. BVDV-E(rns) deletions in a CP7 background could be successfully complemented with Bungowannah virus-E(rns) if Bungowannah virus-E(rns) and BVDV-E1 were expressed without proteolytic cleavage between both proteins. Another key aspect of this study was the establishment of an efficient method for concentration and purification of infectious BVDV. For the first time, BVDV mutants with FLAG-tagged E(rns) and E2 proteins were generated, purified by affinity tag chromatography, and analyzed by electron microscopy. Spherical particles with diameters of 43-58 nm could be observed by negative staining electron microscopy. By immunogold labelling as well as by affinity tag purification an association of E(rns) and E2 with the viral envelope could be demonstrated. This method can serve as a basis for further studies about the morphogenesis of pestiviruses.

Download full text files

Export metadata

Additional Services

Share in Twitter Search Google Scholar
Metadaten
Author: Anne Wegelt
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001133-9
Title Additional (English):Analysis of the structural protein E(rns) of bovine viral diarrhea virus
Advisor:PD Dr. Martin G. Beer, Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas C. Mettenleiter
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2011/12/14
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2011/10/10
Release Date:2011/12/14
GND Keyword:Elektronenmikroskopie, Pestivirus, Virusdiarrhoe-Mucosal-Disease-Virus
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie
MSC-Classification:92-XX BIOLOGY AND OTHER NATURAL SCIENCES / 92Cxx Physiological, cellular and medical topics / 92C40 Biochemistry, molecular biology